非培養技術在干酪微生物群落分析中的應用

莫蓓紅，孫立國

(光明乳業股份有限公司乳業研究院，乳業生物技術國家重點實驗室，上海 200436)

非培養技術在干酪微生物群落分析中的應用

莫蓓紅，孫立國

(光明乳業股份有限公司乳業研究院，乳業生物技術國家重點實驗室，上海 200436)

非培養方法在食品行業中的應用還處于起步階段。本文綜述非培養方法在分析干酪中微生物群落結構以及監測微生物群落結構在干酪生產和成熟過程中演替的應用現狀。主要介紹已被廣泛用于分析干酪中微生物群落結構的DNA指紋圖譜技術，包括PCR-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術、PCR-時間溫度梯度凝膠電泳(PCR-TTGE)技術、單鏈構象多態性PCR(SSCP-PCR)技術以及變性高效液相色譜(DHPLC)技術等。此外，本文還對非培養技術的優點和局限性進行分析，展望非培養方法在干酪行業的應用前景，認為將非培養方法和傳統培養方法結合使用才是研究微生物生態的最好途徑。

非培養方法；干酪；DNA指紋圖譜技術；微生物群落

干酪的制作可追溯到8000年前，那時的中東人發明了世界上第一種牛奶發酵食品[1]。發展至今，干酪擁有1000多種不同的形式和口味，在世界各地都廣受歡迎[2]。絕大多數干酪都是由牛奶、凝乳酶、食鹽和微生物菌種這些基本原料通過酸化、凝乳、排乳清和成熟等工藝步驟制得的。特性不一的各類干酪就是通過不同的原料組合或者工藝參數改變得到的。微生物群落的組合和活性是所有這些參數中最不容易控制的。因為干酪的微生物群落中不僅包括乳酸菌發酵劑，而且還包括非發酵劑乳酸菌，其他細菌、酵母和絲狀真菌等二級微生物群落。二級微生物群落在干酪的制作和成熟過程中是不斷發展變化的，這對干酪的物理和化學特性的改變起到了很大的作用。由于干酪制作和成熟過程中的各個階段都會對其中的微生物組成形成選擇壓力，因此產生了微生物群落的演替[3]。雖然所有食品中微生物群落的多樣性都毋庸置疑的不及環境(例如土壤)中的微生物群落，但是復雜的動力學變化和相互作用使得干酪中的微生物群落變得難以控制。如果能夠充分了解干酪中微生物群落的結構和動力學變化，那么人們就能夠更加了解干酪中微生物的生長和代謝是如何改變干酪特性的。例如，通過控制微生物的組成或者改變其中某種或某些種類微生物的數量，以得到更佳的某種感官特性或者預防質量缺陷和酸敗等。目前為止，人們已經通過傳統的培養方法以及少量的分子生物學技術對干酪中的細菌和真菌群落進行了部分鑒定。

同其他環境一樣，干酪中的微生物可以通過傳統的培養方法和非培養法進行種水平上的鑒定。傳統的培養方法要求必須先對微生物進行分離培養獲得純培養，然后再通過菌落形態、生化特性或者基因特性進行鑒定。經過多年發展，基于培養的分析方法已經在分析干酪制作過程中的微生物群落結構方面發揮了重要的作用。然而，培養方法耗時很長，而且培養技術復雜繁冗，需要針對不同種類的微生物設計不同的培養基和培養方法。因此無法勝任監測干酪制作和成熟過程中微生物群落多樣性的任務。此外，一些數量較低的菌種在分離培養過程中會由于優勢種群的生存競爭而無法生長[4]，還有一些菌種無法用現有的技術獲得分離培養[5-7]。因此培養依賴方法的群落分析結果無法準確表征實際的微生物群落，甚至有時會曲解其中的微生物多樣性。

對于群落中的微生物是如何在它們的自然生境中共同生存和生長方面的認識還非常有限，而且目前也沒有一種培養基能夠完全模擬微生物群落的生存環境，因此必須要使用非介入性的非培養方法。隨著分子生物學的不斷發展，環境微生物群落的分析越來越依賴于基于DNA(或RNA)基因序列分析技術的非培養方法。非培養技術的根本在于從樣品中直接提取總DNA(或RNA)，再加上后繼的基因指紋圖譜技術等整體性分析，就能夠克服傳統的培養方法所帶來的弊端，使人們能夠更加接近環境中微生物的真實群落結構和多樣性。這類方法更加快速而準確，更加適合于分析微生物群落隨時間的演替，使得人們能夠詳盡研究干酪中微生物的群落動力學。

1 非培養技術及其在干酪微生物群落分析中的應用

非培養技術是以微生物的核酸(基因組DNA或RNA)序列信息為依據，通過分析環境樣品中核酸分子的種類和數量來反映該群落中微生物的種類和數量。由于每種微生物細胞都具有其獨特的核酸分子，其序列組成也有各自獨特的特征，因此，通過直接從環境樣品中提取所有微生物的核酸(基因組總DNA或RNA)，依據核苷酸序列的不同，分析這些DNA或RNA的種類和相對數量，就可以反映出微生物的種類組成以及數量比例情況，從而對微生物的群落結構得到一個比較客觀、全面的認識。

1.1 基因克隆文庫分析

不經純培養，直接提取環境樣品中微生物細胞的總基因組DNA，環境基因組總DNA是環境中各種微生物基因組的混合物，通過分析微生物基因組DNA的組成可以反映樣品中微生物種類組成，這是因為微生物的基因組DNA序列具有種屬特征，可以成為識別和鑒定微生物種屬地位的可靠指標。但由于環境樣品中微生物DNA的組成過于復雜，不宜直接對這些DNA混合物進行序列分析。一般需與特定的PCR方法相結合，通過對擴增得到的帶有進化信息或某種功能信息的標記基因的組成進行分析，而推知整個系統的組成結構。理論上，從干酪樣品中提取總DNA，然后通過構建克隆文庫對不同的克隆基因片段進行測序，就能夠獲得樣品中微生物真實的群落結構。不過這需要進行大規模的克隆和測序以確保其中所有的物種都被測序，即使克隆測序的成本在逐年下降，但如果作為日常基本的分析方法仍顯得十分昂貴。在已有的相關文獻[8-10]報道中，這種測序的方法僅僅作為一種其他分析技術的補充手段被應用于干酪微生物群落分析。例如Carraro等[11]2010年將傳統培養法、實時定量PCR分析法與構建16S克隆文庫測序法相結合，測定了Montasio干酪在制作過程中微生物群落結構的演替變化。結果顯示，S. thermophilus是整個Montasio干酪成熟過程中的優勢乳酸菌種。同時Pseudomonasspp.和Lactococcus piscium存在于干酪成熟的起始階段。

1.2 DNA指紋圖譜分析

基于基因克隆文庫分析的限制因素，另外一類不需要大規模克隆測序的分子分析方法得到了廣泛應用。即基于凝膠電泳或色譜原理的DNA片斷指紋圖譜分析法。這些方法的基本原理和在干酪微生物群落分析中的應用簡介從以下幾個方面來闡述。

1.2.1 PCR-變性梯度凝膠電泳和PCR-時間溫度梯度凝膠電泳

傳統的核酸電泳分離主要是依據分子的大小和所帶電荷的多寡，當待分離核酸的長度相同或相近時，很難達到分離的目的。而變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)不是基于核酸分子質量的不同將DNA片斷分開，而是根據序列的不同，將片斷大小相同但堿基組成不同的DNA序列分開。當雙鏈DNA分子在含梯度分布的變性劑(如尿素、甲酰胺)的聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳時，因其解鏈的速度和程度與其序列密切相關，所以具有不同序列的DNA片斷就會滯留于凝膠的不同位置，結束電泳時，形成相互分開的帶譜。然而一旦雙鏈DNA完全解鏈成單鏈DNA，它們又能在膠中繼續遷移，從而影響電泳結果。因此，為了調節目的序列的解鏈行為，在PCR擴增目的片斷時，需在某一引物的5＇端人為地加上一段約40個富含GC堿基的序列，稱之為“GC帽”或“GC夾子”(GC-clamp)，它的解鏈溫度很高，因此可以防止DNA片斷的完全解鏈，從而提高DNA片斷在DGGE/TGGE膠中的分離效果。理論上認為，只要選擇的電泳條件如變性劑梯度、溫度范圍、電泳時間、電壓等足夠精細，有一個堿基差異的DNA片斷都可被分開。時間溫度梯度凝膠電泳(temporal temperature gradient gel electrophesis，TTGE)與DGGE原理類似，只是不需化學變性劑的梯度，用恒定的變性劑濃度制膠，在電泳過程中緩沖液的溫度逐漸升至最高，因此，電泳過程的變性環境是由凝膠中恒定濃度的變性劑和逐漸升高的電泳溫度共同完成，快速而高效，相比DGGE具有更高的可重復性。

PCR-DGGE由Fischer等[12]于20世紀80年代初期發明，最初主要用于檢測DNA突變。1993年Muyzer等[13]首次將該技術應用于復雜微生物群落的研究，此后10年，眾多研究者運用變性-溫度梯度凝膠電泳(DGGE-TTGE)技術進行了大量環境微生物群落結構的研究工作，該項技術已經發展成了一項主要的微生物分子生態學分析方法。PCR-DG/TTGE也是目前在乳制品特別是干酪產品微生物群落研究中應用最為廣泛的分子分析技術[14-16]。PCR-DGGE技術的優勢在于圖譜中的電泳條帶能夠直接從丙烯酰胺凝膠中提取并測序，因此也可以對任何感興趣的條帶進行測序，通過與數據庫中的已知序列對比獲得更多的信息。

近年來，PCR-DG/TTGE技術已經被成功地用于研究多種手工奶酪中細菌群落的多樣性、生物活性以及制作工程中的生物動力學變化。干酪中的復雜微生物生態系統由細菌、酵母和霉菌組成，其中細菌是奶酪生產過程中的主要的群體，2002年Ogier等[15]用PCR-TTGE技術對奶酪中細菌群落結構進行了研究，通過對主要條帶測序分析發現有Lactobacillus、Lactococcus、Leuconostoc、Enterococcus、Pediococcus、Streptococcus和Staphylococcus屬的成員存在。Randazzo等[17]于2002年使用PCR-DGGE技術研究了微生物群落在Ragusano干酪生產和成熟過程中的動力學變化，并對多種不同Ragusano手工干酪中的微生物群落結構進行了對比。結果表明，手工干酪中微生物群落的多樣性較使用商業化發酵劑生產的干酪要更加復雜。同樣的方法也被應用于揭示細菌群落結構在Pecorino Siciliano干酪的整個生產過程中的動力學變化，對Pecorino Siciliano干酪成品的研究表明其中最主要的優勢菌群為Streptococcus bovis和L. lactisspecies[18]。2005年Florez等[19]運用PCR-DGGE技術和傳統培養技術對藍紋干酪Spanish blue-veined Cabrales Cheese)中的微生物群落進行了研究，兩種方法的結果基本一致，不過通過對DGGE圖譜中條帶的測序表明97%的序列來自已知的可培養種群，而另外的3%則為未被培養的種群。2010年Alegria等[20]同樣運用PCR-DGGE的方法和傳統的培養方法分別研究了藍紋干酪中微生物群落在制作和成熟過程中的組成和變化。Streptococcus thermophilus在非培養方法中被檢測到而在培養方法中則未被檢測到。在其他主要微生物的群落結構和演替方面，兩種研究方法的結果非常接近。這些發現表明合理運用非培養的分子生物學技術可以獲得傳統培養方法所不能得到的信息。PCR-DGGE和傳統培養方法的研究結果也并非總是非常相似，Kafili等[21]2009年研究伊朗傳統Lighvan干酪的微生物群落結構時發現，雖然PCR-DGGE和培養法的結果都顯示Lactococcus lactis和Lactobacillusspp.為優勢菌，但在研究Lactobacillus屬中具體的優勢種時兩種方法的結果出現了差異。PCR-DGGE顯示Lactobacillus curvatus和Lactobacillus sakei為優勢種，而培養法顯示Lactobacillus paraplantarum，Lactobacillus paracasei，Lactobacillus brevis和Lactobacillus plantarum為可培養的優勢種。2010年Alessandria等[22]同樣用PCR-DGGE和培養法研究了Planalto de Bolona干酪中的微生物群落結構，在表征真菌群落時培養方法顯示Candida屬為整個制作過程中的優勢真菌，而PCR-DGGE的結果顯示Aureobasidium pullulans是真菌群落中的優勢菌。

1.2.2 單鏈構象多態性PCR技術

單鏈構象多態性PCR(single-strand conformation polymorphism，SSCP-PCR)技術的理論基礎是單鏈DNA具有序列特異性的二級結構，序列組成上的差異(至少1個堿基的差異)也會影響這種二級結構，而這種變化可以通過非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測得到。分析樣品時，雙鏈DNA首先要變性為單鏈后，再上樣電泳分析，不同的DNA單鏈由于其二級結構不同，就會電泳到不同的位置，從而進行分離，得到群落結構圖譜。SSCP-PCR技術本來是用于臨床鑒定基因突變，近年來被應用到微生物生態學的研究[23-24]。SSCP-PCR技術相比PCR-DG/TTGE技術可以同時分析更多的樣品，分析更加容易和快速，因為它不需要構建電泳梯度，也不用添加GC夾子。因此SSCP-PCR技術更加適合用于分析環境中微生物群落在不同時間或空間條件下的群落結構演替。

近年來，該技術被用來分析干酪樣品中的微生物群落結構以及干酪生產和成熟過程中微生物群落結構的演替。如Duthoit等[25]用16S rRNA基因的SSCP對奶酪生產過程中細菌群落結構的動態變化進行了分析研究，發現從3個農民提供的3份樣品得到的圖譜顯著不同。Saubusse等[26]運用SSCP-PCR技術通過對不同干酪樣品中微生物群落的分析來區別其中的微生物群落是否具有抑制沙門氏菌生長的功能。結果表明，通過對16S rRNA基因的V2區片斷進行SSCP分析，能夠將用同種工藝生產的不同干酪樣品區別開，然后再通過與具有抑制沙門氏菌微生物的分析圖譜進行對比，就能判斷出其是否對沙門氏菌具有抑制作用。此外，Callon等[27]運用SSCP技術成功對3種傳統Registered Designation of Origin (R.D.O.) Salers cheeses中的酵母菌群落結構進行了分析。通過與傳統培養方法的對比表明SSCP分析的結果非常準確，證明該技術可以被用來快速分析干酪樣品在制作過程中的酵母菌群落演替。2009年Mounier等[28]運用SSCP-PCR法和傳統培養法對市售Livarot干酪表面的微生物群落結構進行了研究。培養法分離出細菌經過SSCP去重復后進行基因測序鑒定，同時從樣品中提取的總DNA運用SSCP-PCR法進行分析。結果兩種方法均表明主要的優勢細菌為Microbacterium gubbeenense，Leucobacter komagatae以及Gamma變形菌綱的革蘭氏陰性菌。

1.2.3 末端限制性片段長度多態性分析

末端限制性片段長度多態性(terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)分析群落結構的一般步驟是：在提取樣品中微生物的總DNA后，先用帶有熒光標記的細菌通用性引物微生物群落的16S rRNA基因進行擴增，然后選用合適的限制性內切酶對PCR擴增產物進行切割。酶切產物最后通過測序凝膠或毛細管自動測序儀進行分離檢測。該方法只能檢測帶有熒光標記的酶切片段，因此最后得到的結果只是PCR產物的末端。不過由于系統分類地位不同的細菌的16S rRNA基因各自的酶切識別位點不同，它們各自帶有熒光的末端片段長短也不同，因此能夠在測序膠中就能被分辨開。同時，熒光的強度還能反映出各微生物種群在整個群落中的分布比例。

T-RFLP是近幾年來剛發展起來的一項新技術，它既可以用來鑒定菌株，也可以對比分析不同的群落結構，還可以評估特定群落中系統進化類群的細菌多樣性。Liu等[29]最先使用T-RFLP方法來分析細菌群落結構，他們發現該技術可以區分一個典型的細菌群落中所有的成員，圖譜與預測的完全一致。T-RFLP技術成功地區分了白蟻后腸、水體沉積物、兩個不同的活性污泥等環境中的細菌群落結構，證明了該技術可以快速比較微生物群落結構的差異及分析不同生態系統中微生物的多樣性。Rademaker等[30]于2005年運用T-RFLP技術分析了微生物群落結構在干酪的成熟過程中的動力學變化。該實驗的研究對象為3種不同的Tilsit表面涂抹成熟干酪，在這些干酪成熟的8周當中，運用T-RFLP技術對干酪表面的微生物群落組成進行了分析。結果發現，涂抹發酵劑中的菌種存在于整個成熟過程中，而來自環境中的微生物數量多數在2～4周后達到最大，而后又迅速降低，甚至于8周后無法檢測到。不過Corynebacterium屬是個例外，在干酪完全成熟后仍然是其表面的優勢菌。Arteau等[31]2010年運用T-RFLP法對Camembert干酪中的真菌群落結構進行了研究。分析結果表明干酪表面與內部、不同批次干酪、不同生產工藝以及不同成熟時間制得的干酪中真菌的群落結構都有所不同。研究中共檢測和鑒定出了以下9種真菌：Cladosporium、Debaryomyces、Geotrichum、Kluyveromyces、Mucor、Penicillium、Pichia、Saccharomyces以及Yarrowia。

1.2.4 變性高效液相色譜技術

變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography，DHPLC)技術采用高壓閉合液相流路, 利用離子對反相液相色譜技術進行核酸片段的分離和分析。采用的離子對為三乙基胺醋酸鹽緩沖溶液(TEAA)，它既是疏水的又帶正電荷，既能與DNA片段分子上帶負電荷的磷酸根基團反應，同時疏水基團又能與固定相C18鏈的疏水基團發生疏水作用力而相互吸引。TEAA由此作為“橋分子”將DNA分子片斷吸附在固定相上面。當用流動相對色譜柱進行洗脫時，與固定相親和力不同的DNA分子就能相互區分開來。DHPLC最初被設計用來臨床上檢測單核苷酸多肽性[32]，由于異源雙鏈DNA分子更加容易部分解鏈成單鏈而與固定相的親和力下降，更早的被流動相洗脫，從而達到分離的目的。

DHPLC技術在分析微生物群落結構方面有著美好的發展前景。根據Barlaan等[33]的描述，在特定變性條件和適當洗脫緩沖液的濃度梯度條件下，大小相同但堿基序列不同的DNA分子由于具有不同的解鏈特性，會有不同的洗脫時間，因此能夠得以相互分離。DHPLC具有通量高、自動化的特點，并且洗脫出來的PCR擴增片斷收集后可直接用于測序，與PCR-DG/TTGE等方法相比更加方便快捷。目前該方法已經成功用于分析海水微生物群落和監測腸道微生物菌群。此外Ercolini等[34]于2008年第一次將DHPLC技術用于分析食品相關樣品中的微生物多樣性。采用了DHPLC和DGGE兩種方法分析了用于制作Caciocavallo Silano PDO干酪的天然乳清發酵劑(natural whey cultures，NWC)中的細菌多樣性。對兩種方法研究結果的比較后證明DHPLC技術在研究食品微生物群落多樣性方面至少和DGGE同樣有效。在此之后，Mounier等[35]2010年成功運用DHPLC技術分析鑒定了Red Smear干酪表面的酵母菌組成。

2 非培養方法的局限性和缺陷

任何分析方法都有一定的局限性，非培養方法雖然能夠避免傳統培養方法的不足，但其自身也有一定的缺陷。本綜述所提及的大多數非培養方法都基于DNA序列分析的分子生物學技術，而分子生物學方法在分析微生物群落結構組成時的局限性在于：首先在提取干酪樣品中總DNA前的樣品處理過程很容易改變微生物群落的原始結構，而不同微生物在提取DNA時的裂解效率不同也會使得DNA的提取和純化產生一定的偏差。其次，PCR技術本身也存在不足，1992年Reysenbach等[36]發現用rDNA基因在PCR過程中會產生優先擴增現象，只擴增部分細菌的D NA，造成了群落中原始成員的減少。而干酪樣品成分復雜，提取DNA時所殘留的雜質很可能會成為PCR擴增抑制劑，影響PCR效果[37-38]。

此外，目前用于分析干酪樣品微生物群落結構的非培養方法，如PCR-DG/TTGE、SSCP-PCR、T-RFLP、DHPLC甚至是生物芯片技術都有可能造成共遷移或共洗脫現象[8-10,13-14]。不過由于允許對電泳條帶或洗脫物中的PCR擴增產物進行測序，DGGE、DHPLC等技術更容易克服這種缺陷。與共遷移現象相反，DNA指紋圖譜技術的另一個普遍問題在于占微生物群落1%以下的弱勢種群很難被檢測到，微弱的電泳條帶或洗脫峰很難與背景噪音區別開來[8]。盡管如此，非培養方法已經被證明為監測干酪生產和成熟過程中微生物群落結構演替的有效手段。

3 非培養技術在干酪微生物群落分析中的應用前景

非培養技術是一門剛剛興起的微生物群落結構分析技術，近年來受到科學家的青睞取得了令人矚目的成就，不過這些技術仍然處于發展階段，特別是在食品領域還處于起步階段。無論是傳統的培養法還是基于分子生物學技術的非培養法，都是試圖揭示環境中微生物群落結構的一種途徑。本文中提及的非培養方法都是近年來在研究干酪為生物群落結構中應用較為廣泛的方法，在近年來的研究中已經展現出了巨大的優越性，成為研究干酪以及其他食品中微生物群落結構的有效工具。不過每種方法都有自身的優勢和不足。為了利用各種分析方法的優勢，彌補它們技術本身的缺陷，將不同分析方法結合起來進行研究近年來已經成為了一種新的趨勢。例如2008年Ercolini等[34]將PCR-DGGE、DHPLC和隨機擴增多態性DNA-PCR(RAPD-PCR)這3種方法結合研究了用于制作Caciocavallo Silano PDO干酪的乳清發酵劑中的微生物群落結構。2010年Arteau等[31]將T-RFLP法和自動核糖體間隔基因分析(automated ribosomal intergenic spacer analysis，ARISA)法相結合對Camembert干酪中的真菌群落結構進行了研究。此外，克隆文庫法已經被廣泛地與其他方法相結合，成為干酪中微生物群落結構的有效途徑。

本文提及的大部分非培養法都是基于PCR擴增的方法，必然會帶有PCR擴增自身的缺陷。這些方法之間的不同組合也無法彌補PCR擴增本身帶來的不足。因此基于其他原理的分析技術需要被引入以加強對環境中微生物群落真實結構的認識。熒光原位雜交技術(fluorescence in situ hybridization，FISH)結合了分子生物學的精確性和顯微鏡的可視性信息，可以在自然環境中監測和鑒定不同的微生物個體，提供微生物的形態學、數量信息、空間分布、細胞環境等信息，整個分析過程對樣品的介入性很小，可以彌補PCR擴增所帶來的偏差。將FISH和其他分子生物學技術的結合使人們能夠得到更接近真實情況的微生物群落分布信息。2009年Mounier等[28]首次對此做出了嘗試，用3種方法系統地對市售的Livarot干酪表面微生物群落結構進行了研究。首先用傳統培養法對市售的細菌和真菌進行了分離培養，分離所得菌株通過SSCP分析去重復后進行16S rRNA基因測序鑒定，再用SSCP-PCR分析法對從干酪樣品分離的總DNA進行分析，最后FISH分析法被用來對干酪表面的微生物進行綱水平的多樣性分析。FISH分析法中使用的特異性探針能夠直接對干酪中的微生物進行檢測，從而提供了微生物群落多樣性的最直接證據。基于rRNA的分子方法與FISH分析法的結合被證實是一種研究干酪表面微生物群落的有效手段。

數10年來人們一直致力于對干酪樣品以及整個生產和成熟過程中微生物群落結構的研究，從傳統培養法到分子生物學技術，其目的不僅僅是獲得微生物群落的分布信息，更重要的是將這些信息與微生物的功能聯系起來，從而能夠對干酪產品的開發和生產起到指導性作用。非培養方法雖然可以彌補傳統培養方法的不足，利用不同分子生物學技術可以獲得更加真實的微生物群落多樣性，不過這并不意味著可以摒棄培養方法。非培養方法可以快速得到群落的整體結構情況，而要得到系統中在功能上起重要作用的菌群則需要傳統培養方法。因此，單憑傳統培養的方法或現代的分子生物學技術對干酪或其他生態系統進行研究，都不能很好地達到研究目的。已經有眾多研究者認識到了將多種方法結合使用的重要性，本文已經多次提及這樣的例子，在此不再贅述[11,20-21,28]。用分子技術指導分離培養的方向，用分離培養的結果對分子方法進行驗證，二者互為補充，已經成為研究干酪以及其他食品中微生物生態學的新方向。

[1] FOX P F, GUINEE T P, COGAN T M, et al. Fundamentals of Cheese Science[M]. Gaithersburg, MD, USA: Aspen Publications, 2000.

[2] SANDINE W E, ELLIKER P R. Microbially induced flavors and fermented foods: flavor in fermented dairy products[J]. Agric Food Chem,1970, 18(4): 557-566.

[3] COPPOLA S, BLAIOTTA G, ERCOLINI D. Dairy products[M]//COCOLIN L, ERCOLINI D. Molecular techniques in the microbial ecology of fermented foods. New York, USA: Springer, 2007: 31-90.

[4] HUGENHOLTZ P, GOEBEL B M, PACE N R. Impact of cultureindependent studies on the emerging phylogenetic view of bacterial diversity[J]. Bacteriol, 1998, 180(18): 4765-4774.

[5] WARD D M, WELLER R, BATESON M M. 16S rRNA sequences reveal uncultured inhabitants of a well-studied thermal community[J].FEMS Microbiol, 1990, 75(2/3): 105-116.

[6] WARD D M, BATESON M M, WELLER R, et al. Ribosomal RNA analysis of microorganisms as they occur in nature[J]. Adv Microb Ecol,1992, 12: 219-286.

[7] HEAD I M, SAUNDERS J R, PICKUP R W. Microbial evolution,diversity, and ecology: a decade of ribosomal RNA analysis of uncultivated microorganisms[J]. Microb Ecol, 1998, 35(1): 1-21.

[8] FEURER C, VALLAEYS T, CORRIEU G, et al. Does smearing inoculum reflect the bacterial composition of the smear at the end of the ripening of a French soft, red-smear cheese?[J]. Dairy Sci, 2004, 87(10):3189-3197.

[9] DELBES C, ALI-MANDJEE L, MONTEL M C. Monitoring bacterial communities in raw milk and cheese by culture-dependent and -independent 16S rRNA gene-based analyses[J]. Appl Environ Microbiol, 2007,73: 1882-1891.

[10] El BARADEI G, DELACROIX-BUCHET A, OGIER J C. Biodiversity of bacterial ecosystems in traditional Egyptian Domiati cheese[J]. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(6): 1248-1255.

[11] CARRARO L, MAIFRENI M, BARTOLOMEOLI I, et al. Comparison of culture-dependent and -independent methods for bacterial community monitoring during Montasio cheese manufacturing[J]. Research in Microbiology, 2011, 162(3): 231-239.

[12] FISCHER S G, LERMAN L S. DNA fragments differing by single basepair substitutions are separated in denaturing gradient gels: correspondence with melting theory[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1983, 80(6):1579-1583.

[13] MUYZER G, WAAL E, UITTERLINDEN A. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA[J]. Appl Environ Microbiol, 1993, 59(3): 695-700.

[14] LAFARGE, OGIER V, GIRARD J C, et al. Le potentiel de la TTGE pourletude bacterienne de quelques laits crus[J]. Le Lait, 2004, 84(1/2):169-178.

[15] OGIER J C, SON O, GRUSS A, et al. Identification of the bacterial microflora in dairy products by temporal temperature gradient gelelectrophoresis[J]. Appl Environ Microbiol, 2002, 68(8): 3691-3701.

[16] OGIER J C, LAFARGE V, GIRARD V, et al. Molecular fingerprinting of dairy microbial ecosystems by use of temporal temperature and denaturing gradient gel electrophoresis[J]. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(9): 5628-5643.

[17] RANDAZZO C L, TORRIANI S, AKKERMANS A D L, at el. Diversity,dynamics, and activity of bacterial communities during production of an artisanal Sicilian cheese as evaluated by 16S rRNA analysis[J]. Appl Environ Microbiol, 2002, 68(4): 1882-1892.

[18] RANDAZZO C L, VAUGHAN E E, CAGGIA C. Artisanal and experimental Pecorino Siciliano cheese: microbial dynamics during manufacture assessed by culturing and PCR-DGGE analyses[J]. Int J Food Microbiol, 2006, 109(1/2): 1-8.

[21] KAFILI T, RAZAVI S H, DJOMEH Z E, et al. Microbial characterization of Iranian traditional Lighvan cheese over manufacturing and ripening via culturing and PCR-DGGE analysis: identification and typing of dominant lactobacilli[J]. Eur Food Res Technol, 2009, 229(1): 83-92.

[22] ALESSANDRA V, DOLCI P, RANTSIOU K. Microbiota of the Planalto de Bolona: an artisanal cheese produced in uncommon environmental conditions in the Cape Verde Islands[J]. World J Microbiol Biotechnol, 2010, 26(12): 2211-2221.

[23] HEAD I M, SAUNDERS J R, PICKUP R W. Microbial evolution,diversity, and ecology: a decade of ribosomal RNA analysis of uncultivated microorganisms[J]. Microb Ecol, 1998, 35(1): 1-21.

[24] SCHWIEGER F, TEBBE C C. A new approach to utilize PCR-singlestrand-conformation polymorphism for 16S rRNA gene-based microbial community analysis[J]. Appl Environ Microbiol, 1998, 64(12): 4870-4876.

[25] DUTHOIT F, GODON J J, MONTEL M C. Bacterial community dynamics during production of registered designation of origin Salers cheese as evaluated by 16S rRNA gene single-strand conformation polymorphism analysis[J]. Appl Environ Microbiol, 2003, 69(7): 3840-3848.

[26] SAUBUSSE M, MILLET L, DELBES C, et al. Application of single strand conformation polymorphism-PCR method for distinguishing cheese bacterial communities that inhibitListeria monocytogenes[J]. Int J Food Microbiol, 2007, 116: 126-135.

[27] CALLON C, DELBES C, DUTHOIT F, et al. Application of SSCPPCR fingerprinting to profile the yeast community in raw milk Salers cheeses[J]. Syst Appl Microbiol, 2006, 29(1): 172-180.

[28] MOUNIER J, MONNET C, JACQUES N, et al. Assessment of the microbial diversity at the surface of Livarot cheese using culture-dependent and independent approaches[J]. International Journal of Food Microbiology, 2009, 133(1/2): 31-37.

[29] LIU W, MARSH T L, CHENG H, et al. Characterization of microbial diversity by determining terminal restriction fragment length polymorphisms of genes encoding 16S rRNA[J]. Appl Environ Microbiol, 1997,63(11): 4516-4522.

[30] RADEMAKER J L W, PEINHOPF M, RIJNEN L, et al. The surface microflora dynamics of bacterial smear-ripened Tilsit cheese determined by T-RFLP DNA population fingerprint analysis[J]. Int Dairy J, 2005,15(6/9): 785-794.

[31] ARTEAUA M, LABRIEA S, ROY D. Terminal-restriction fragment length polymorphism and automated ribosomal intergenic spacer analysis profiling of fungal communities in Camembert cheese[J]. Int Dairy J,2010, 20(8): 545-554.

[32] FRUEH F W, NOYER-WEIDNER M. Use of denaturing high-performance liquid chromatography for rapid detection and identification of sevenCandidaspecies[J]. J Clin Microbiol, 2005, 43(12): 5912-5915.

[33] BARLAAN E A, SUGIMORI M, FURUKAWA S, et al. Profiling and monitoring of microbial populations by denaturing high-performance liquid chromatography[J]. J Microbiol Methods, 2005, 61(3): 399-412.

[34] ERCOLINI D, FRISSO G, MAURIELLO G, et al. Microbial diversity in natural whey cultures used for the production of Caciocavallo Silano PDO cheese[J]. Int J Food Microbiol, 2008, 124(2): 164-170.

[35] MOUNIER J, le BLAY G, VASSEUR V, et al. Application of denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC) for yeasts identification in red smear cheese surfaces[J]. Lett Appl Microbiol, 2010, 51(1): 18-23.

[36] REYSENBACH A L, GIVER L J, WICKHAM G S, et al. Differential amplification of rRNA genes by polymerase chain reaction[J]. Appl Environ Microbiol, 1992, 58(10): 3417-3418.

[37] WINTZINGERODE V F, GOBEL U B, STACKEBRANDT E. Determination of microbial diversity in environmental samples: pitfalls of PCR-based analysis[J]. FEMS Microbiol Rev, 1997, 21(3): 213-229.

[38] ERCOLINI D. PCR-DGGE fingerprinting: novel strategies for detection of microbes in food[J]. J Microbiol Methods, 2004, 56(3): 297-314.

Application of Culture-independent Methods for Analyzing Microbial Communities in Cheese: A Review

MO Bei-hong，SUN Li-guo
(State Key Laboratory of Dairy Biotechnology, Dairy Research Institute, Bright Dairy and Food Co. Ltd., Shanghai 200436, China)

The application of culture-independent methods in food industry is still in the preliminary stage. In this paper, the application of the most common culture-independent approaches for describing both bacterial and fungal communities in cheese and for monitoring microbial community in cheese manufacturing and ripening process has been reviewed. The most commonly used DNA fingerprinting techniques for investigating microbial communities in cheese are introduced, which include PCRDGGE, PCR-TTGE, SSCP-PCR, DHPLC and other techniques. Furthermore, the benefits, pitfalls and perspectives of cultureindependent methods in cheese are discussed. Based on the discussion, a polyphasic approach with the combination of culturedependent and culture-independent methods may be the best strategy to achieve more accurate structures of microbial communities.

culture-independent methods；cheese；DNA fingerprinting techniques；microbial communities

TS252.53

A

1002-6630(2012)05-0293-06

2011-04-06

上海市科委啟明星項目(09QB1400200)

莫蓓紅(1978—)，女，工程師，碩士研究生，主要從事乳品發酵技術與新型干酪的研究與開發。E-mail：mobeihong@brightdairy.com