基因工程HBsAg純化技術的研究進展

潘太健 ，馬 瑞 ，曹春來 ，彭 韙 ，孫萬邦 ，肖擁軍

(1.珠海聯邦制藥股份有限公司生物研究所，廣東 珠海 519041; 2.遵義醫學院珠海校區·貴州省免疫學研究生教育創新基地，廣東 珠海 519041)

乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)存在3種顆粒形式，分別是Dane顆粒、絲狀顆粒和球形顆粒[1]。病毒包膜有S蛋白、Pre-S1蛋白和Pre-S2蛋白3種表面抗原蛋白，分別構成了大蛋白(L，Pre-S1+Pre-S2+S)、中蛋白(M，Pre-S2+S)和主蛋白(S)3種形式[2]，因Pre-S1和Pre-S2易被宿主蛋白酶降解，通常基因工程生產的乙肝疫苗產品主要成分是由約100個S蛋白、糖和脂組成直徑約22 nm的球形病毒樣顆粒(virus-like Particles，VLPs)，S蛋白病毒樣顆粒的免疫原性是S蛋白單體1000倍以上[3]，HBsAg結構復雜，在純化過程中會受到諸多因素的影響而遭到破壞，免疫原性也隨之降低，整個純化過程的收率只有30%左右。因此，保持HBsAg結構的完整性和理化性質的穩定性是提高收率的關鍵。在此根據HBsAg的結構大小、相對分子質量、帶電性質、疏水性、吸附特性、密度等性質總結了HBsAg在純化的3個階段采用的主流純化技術。

1 蛋白捕獲階段

1．1 等電點沉淀

蛋白質在等電點時，凈電荷為零，分子間作用力減弱，顆粒碰撞凝聚而形成沉淀物，可以利用該性質進行蛋白初步分離。Hardy等[4]在大規模生產HBsAg時，將破碎液的pH從8調到4.5，目的蛋白和等電點在4.5左右的雜蛋白及非蛋白脂類被沉下來，除去了溶解于此環境的其他雜蛋白，起到了初步分離的作用。

1．2 微濾

微濾是一項根據不同物質間顆粒大小的差異進行分離的技術，根據蛋白顆粒大小選擇適合膜孔徑的濾膜和壓力進行篩分或截留。2007 年，Ottone 等[5]運用了 0.2 μm 微濾膜除去大量雜蛋白，結合截留相對分子質量為300×103或500×103的超濾膜包進行超濾濃縮目的蛋白。這種三明治式的純化方法是非常有效的，在更換緩沖液的同時使得蛋白濃縮了5倍，60%的雜蛋白被除去。這也是默克公司的特色純化技術。

1．3 硫酸銨沉淀

硫酸銨沉淀法可用于從大量破碎液中濃縮和沉淀樣品，初步分離蛋白質。Liu等[6]使用20% ～40%飽和度的硫酸銨沉淀畢赤酵母表達的含有HBsAg破碎液30 min，12 500 g離心15 min后，很明顯地清除了雜蛋白。但Yuan等[7]考察漢遜酵母表達的HBsAg時，硫酸銨對HBsAg卻有較大的影響，硫酸銨濃度為0.4 mol/L時，會引起HBsAg聚集，隨著濃度增加，聚集現象更加嚴重，這會改變HBsAg的結構，從而影響其生物活性。可以看出，不同表達系統生產的HBsAg結構和性質有所差異，要對特定的HBsAg的性質進行個性研究。

1．4 聚乙二醇(PEG)沉淀

PEG沉淀是利用空間位阻破壞生物大分子的水化膜來進行蛋白沉淀的一項技術。張焱等[8]在運用PEG沉淀HBsAg時，對PEG相對分子質量、質量濃度、鹽濃度、pH、溫度進行了正交試驗，優化了工藝，最終采用了 PEG6000，質量濃度為0.12 g/L，pH=9.0，溫度為4℃的技術參數，保證了樣品澄清，且單步收率高達96.8%。

1．5 硅膠吸附

盡管硅膠吸附的機制各家說法各異，但其對于HBsAg純化具有以下優點:選擇性除去HBsAg形式(單體，二聚體)，吸附成熟二硫鍵結合的病毒樣顆粒;通過調整緩沖液和洗脫液的pH可成功吸附和解吸HBsAg，pH是硅膠吸附中的關鍵參數。Agraz等[9]運用了Hyflo Super Cell，這是一種非特異性吸附硅膠，能使HBsAg顆粒和雜蛋白被吸附到Hyflo Super Cell上，調整洗脫液的pH到8.0～8.25，HBsAg顆粒被解吸下來。

2 蛋白中度純化階段

2．1 離子交換層析

在重組HBsAg分離純化應用中，研究者多運用了DEAE陰離子交換柱，但與疏水層析、分子篩過濾聯合后，總收率卻低于30%，大部分損失在離子交換層析中，故離子交換層析是HBsAg純化工藝的瓶頸步驟[10]。研究人員已采用各種策略來優化該步驟，發現了PEG具有良好的鏈狀柔順性，以其作為保護劑，能保護二硫鍵，促進蛋白結構穩定和單體組裝，使得顆粒更均一，接近天然抗原。Zhou等[11]對PEG流動相中的濃度和相對分子質量進行了對比研究，在流動相中加入1%PEG10000，結果收率和純化程度明顯改善，分離效果良好。

2．2 疏水作用層析

疏水層析是根據蛋白質分子的疏水基團和介質基團間的相互作用力不同來實現分離的，根據高鹽上樣，低鹽洗脫的原理，蛋白質活性回收率高。HBsAg是一種疏水性很強的脂蛋白，在流動相加入乙醇或異丙醇才能洗脫出來，Liu等[6]將樣品經苯基疏水填料上樣后，鹽濃度從8.5%減小到0%進行梯度洗脫，結果均沒有將目的蛋白洗脫下來，最后還是在含有10%乙醇的磷酸鹽緩沖液中洗脫出來，除去了超過90%的雜蛋白，回收率達到81.3%。

2．3 超濾

一般超濾技術在蛋白純化中起濃縮和脫鹽的作用。在HBsAg超濾中，影響蛋白聚集的因素主要是蛋白濃度、相對分子質量和膜孔徑大小，電泳結果卻顯示回流液中只能收到70%～80%的活性HBsAg，說明在超濾過程中HBsAg部分失活，其原因為HBsAg中α-螺旋的降低和γ-轉角的升高引起了蛋白的聚集和變性。2006年，Li等[12]運用高效色譜和在線多角度散色儀掃描研究了漢遜酵母HBsAg在超濾前后結構性質的變化，發現超濾過程中蛋白結構發生了變化，有較多的高聚物產生，蛋白聚集的原因為變性蛋白間的部分位點分子間產生連接。針對這一原因，研究人員在超濾中加入保護劑，提高了活性蛋白收率。

2．4 免疫親和層析

免疫親和層析是利用HBsAg和抗體特異性結合的特點來純化蛋白，S蛋白121～137位的α抗原決定族中121～124位對抗原表位的識別最關鍵，在HBsAg純化過程中，很多宿主蛋白伴隨HBsAg，干擾了其與抗原結合。為了解決此問題，Leyva等[13]在樣品中加入0.1%脫氧膽酸鈉(NaDoc)，結果其結合效率比沒有處理的樣品提高了1.5倍，NaDoc的應用提高了抗原抗體識別能力。Gómez等[14]將 CB-HEP1 anti-HBsAg 用溴化氰(CNBr)法偶聯在Sepharose CL-4B上進行免疫層析來純化從硅藻土中解吸下來的HBsAg，并對抗體的偶聯密度進行了對比研究，結果工藝優化后，得出最佳單抗偶聯密度為3.2 mg MAb/mL。

2．5 硫酸酯纖維素親和層析

硫酸酯纖維素是近年來應用比較熱門的一種親和填料，哺乳動物細胞產生的病毒包膜上的糖基和硫酸酯纖維素表現出很好的親和性，其用于純化HIN5病毒同樣取得很好的分離效果[15]。Jung等[16]在研究HBsAg的L蛋白顆粒時，因為Pre的60～61位和139～140位易被降解，在進行硫酸酯纖維素親和層析之前，對樣品進行了37℃保溫16 h以上的熱處理，這樣可以減少目的蛋白的降解，硫酸酯纖維素層析前的熱處理運用到HBsAg的S蛋白顆粒純化中也可能取得良好純化效果。Zhao等[17]發現熱處理可以促進HBsAg顆粒的成熟，將抗原性提高2～3倍。

3 蛋白精純階段

凝膠過濾層析是根據物質的相對分子質量大小進行分離的技術，各個組分按相對分子質量的大小從大到小依次流出，從而達到分離的目的，凝膠過濾層析經常用于HBsAg的精純中，可以去除HBsAg聚集體和突變體。Nirmala[18]在純化工藝的最后運用了兩步凝膠層析，為了使第2次凝膠精純樣品更均一，在第1次凝膠分子篩得到的樣品中加入胰蛋白酶，37℃保溫處理5 h，結果第2次凝膠層析得到的樣品顆粒大小更均一。

4 展望

隨著純化新方法和新技術的不斷涌現，HBsAg的純化也在不斷進步，雖然HBsAg純化技術不斷成熟，但是還面臨以下問題:HBsAg的顆粒結構在純化中不均一、穩定，導致HBsAg聚集體和突變體的產生;酵母細胞表達的HBsAg總收率低，在30%左右，主要原因在于離子交換層析是其純化的瓶頸;純化收率低，生產成本高，限制了在發展中國家的廣泛應用。研究者正在尋找經濟有效的方法和技術來解決這些問題，提高產量，降低成本。

目前，沒有一個通用的純化模式來分離純化不同表達系統表達出來的HBsAg，因此在工作中，針對特定的HBsAg選擇適合自身的純化流程是最關鍵的。這需要研究HBsAg自身的各種性質，來選擇適合特定HBsAg的純化工藝。相信隨著純化技術的不斷更新和工藝的不斷改進，會得到更高純度和收率的HBsAg。

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