高效液相色譜法同時(shí)測定不同產(chǎn)地枳殼藥材中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、異柚皮苷的含量＊

楊 華 ，鄧義德 ，胡高云

(1．湖南漢森醫(yī)藥研究有限公司，湖南 長沙 410013;2．中南大學(xué)，湖南 長沙 410013)

枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL．及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)[1]，性微寒，味苦、辛、酸，入肺、脾、大腸經(jīng)，具有理氣寬中、行滯消脹的功效，主治胸肋氣滯、脹滿疼痛、食積不化、痰飲內(nèi)停、胃下垂等[2－3]。枳殼中含黃酮、生物堿、糖類和有機(jī)酸等成分，黃酮為枳殼藥材主要有效成分。枳殼主要的黃酮類成分為柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、異柚皮苷、橘紅素、川陳皮素等[4－6]。2010年版《中國藥典(一部)》枳殼藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對柚皮苷和新橙皮苷進(jìn)行含量測定[7]，而異柚皮苷和橙皮苷分別是柚皮苷和新橙皮苷的同分異構(gòu)體，只有連接的糖基為鼠李糖或葡萄糖的差異，且文獻(xiàn)報(bào)道異柚皮苷和橙皮苷具有多種活性[8－9]。因而建立以柚皮苷、新橙皮苷、異柚皮苷、橙皮苷4個(gè)黃酮類成分為指標(biāo)的含量測定方法，可為枳殼藥材質(zhì)量控制提供參考。另以4個(gè)成分為指標(biāo)，考察了不同產(chǎn)地的枳殼藥材最佳采收期。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

美國安捷倫公司1100型液相色譜儀(美國安捷倫公司)，包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、檢測器、工作站;KQ－250DB型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);METTLER 200型電子天平;BP211D型電子分析天平(Sartorius CO．);DHG－9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。柚皮苷對照品(批號(hào)為110722－201111)，新橙皮苷對照品(批號(hào)為111857－201102)，橙皮苷對照品(批號(hào)為110721－200613)，均由中國藥品生物制品檢定所提供;異柚皮苷對照品(上海融禾醫(yī)藥科技有限公司提供，批號(hào)為090926);乙腈、無水乙醇為色譜純，水為純凈水，其他試劑均為分析純。枳殼藥材采自重慶、湖南、江西等地。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱:Venusil XBP C18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈－0．1%甲酸，流動(dòng)相比例見表1;檢測波長:283 nm;流速:1 mL/min;柱溫:30℃，理論板數(shù)按柚皮苷計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2．2 溶液制備

精密稱取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、異柚皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含柚皮苷1 mg、橙皮苷25 μg、新橙皮苷0．45 mg、異柚皮苷80 μg的混合溶液，即得對照品溶液。取樣品中粉0．5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加25 mL 70%甲醇，超聲30 min(功率250 W，頻率40 kHz)，放冷，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:取柚皮苷適量，加甲醇制成每1 mL含柚皮苷1．016 4 mg 的貯備液，分別稀釋成 1 016．4，762．3，508．2，203．3，101．64 μg/mL，進(jìn)樣量 5 μL，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。柚皮苷在 0．5 ～5 μg范圍線性關(guān)系良好，Y=7．559 25X+19．268，r=0．9998。取異柚皮苷適量，加甲醇制成每1mL含異柚皮苷0．4024 mg的貯備液，分別稀釋成 402．4，321．92，241．44，160．96，80．48，16．096 μg/mL，進(jìn)樣量 5 μL，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。異柚皮苷在 0．08 ～2．01 μg范圍線性關(guān)系良好，Y=7．544 7X－2．336 9，r=0．999 8。取橙皮苷適量，加甲醇制成每 1 mL含橙皮苷0．241 2 mg 的貯備液，分別稀釋成 241．2，96．48，48．24，24．12，12．06 μg/mL，進(jìn)樣量 5 μL，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。橙皮苷在 0．06 ～1．2 μg 范圍線性關(guān)系良好，Y=8．661 1X+7．252，r=0．9999。取新橙皮苷適量，加甲醇制成每1mL含新橙皮苷0．9644mg的貯備液，分別稀釋成 964．4，482．2，192．88，96．44，38．576，19．288 μg/mL，進(jìn)樣量 5 μL，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。新橙皮苷在 0．09～4．82 μg范圍線性關(guān)系良好，Y=9．249 4X－18．171，r=0．999 7。見圖 1。

表1 流動(dòng)相比例

精密度試驗(yàn):選中間濃度的對照品溶液混合溶液(柚皮苷508．2 μg/mL、異柚皮苷 160．96 μg/mL、橙皮苷 48．24 μg/mL、新橙皮苷192．88 μg/mL)，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，結(jié)果柚皮苷、異柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的RSD分別為 0．86%，0．92%，1．23%和 1．11%。

重復(fù)性試驗(yàn):取本品(江西，20110712)，按供試品溶液方法制備6份，按上述色譜條件檢測，異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰面積的RSD在0．92% ～1．32%間，說明方法的重復(fù)性良好。

圖1 枳殼藥材HPLC色譜圖

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，按供試品溶液方法制備，按擬訂色譜條件分別在 0，4，8，15，24，48 h 時(shí)進(jìn)行檢測，考察其穩(wěn)定性。結(jié)果異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰面積的RSD為0．24% ～3．40%，表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):取已知含量的樣品溶液1 mL，分別加入對照品適量，按2．2項(xiàng)下方法處理，平行試驗(yàn)6次，測定結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2．4 樣品含量測定

取枳殼樣品，按上述方法測定，按干燥品計(jì)算枳殼中4個(gè)成分的含量，結(jié)果見表3。24批枳殼樣品中異柚皮苷的平均含量為0．59%;柚皮苷的平均含量為6．73%;橙皮苷的平均含量為1．15%;新橙皮苷的平均含量為4．96%。

3 討論

對以水或含水甲醇為溶劑制備枳殼供試品溶液，其4個(gè)成分的提取率、理論板數(shù)、對稱性都接近，峰面積無顯著性差異。但隨著甲醇量的增加，后續(xù)的試驗(yàn)處理更容易，所以選擇70%的甲醇作為供試品溶液的制備溶劑。

采收時(shí)間對枳殼藥材中的化學(xué)成分影響非常大。以重慶的樣本為例，從7月初開始每周分別進(jìn)行采樣，分析結(jié)果不難看出:隨著果實(shí)成熟期的到來，藥材中含量較高的主要成分柚皮苷和新橙皮苷的含量漸漸下降，而2個(gè)含量較低的成分異柚皮苷和橙皮苷的含量有升高的趨勢。說明藥材應(yīng)該在7月中旬以前完成采收。湖南的樣品也如此，3個(gè)產(chǎn)地(益陽、新干、樟樹)的樣品均以小暑前的柚皮苷和新橙皮苷的含量為最高，大暑前降為最低。但從江西產(chǎn)的2個(gè)品種(香橙和臭橙)的枳殼來看，藥材中含量較高的2個(gè)主要成分柚皮苷和新橙皮苷的含量總體上來說在小署前后的變化不大，以小暑前稍高。且2個(gè)品種中的柚皮苷和新橙皮苷的含量相差不大，異柚皮苷和橙皮苷的含量也是同樣如此。從不同產(chǎn)地的情況進(jìn)行分析，3個(gè)產(chǎn)地的樣品以江西和重慶的樣品中指標(biāo)成分的含量較高，但均符合《中國藥典》對枳殼藥材的規(guī)定。通過試驗(yàn)，可以確定枳殼藥材的采收時(shí)間應(yīng)以6月中旬到7月中旬間(小署前后)為宜。

本方法簡便、準(zhǔn)確、可靠，比藥典方法增加了2個(gè)有效成分的含量測定，對枳殼藥材質(zhì)量控制具有一定參考價(jià)值。

表3 樣品含量測定結(jié)果

[1]肖培根．新編中藥志(第2卷)[M]．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2001:443－447．

[2]羅小泉，楊武亮，周至明，等．中藥枳殼藥材的研究概況[J]．江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，18(2):45 －47．

[3]潘雋麗，楊翠平，蘇薇薇．枳殼類藥材的研究概況[J]．中藥材，2003，26(10):768－771．

[4]楊武亮，陳海芳，余寶金，等．枳殼活性化學(xué)成分研究[J]．中藥材，2008，31(12):1 812 －1 815．

[5]付小梅，吳志瑰，褚小蘭，等．枳殼中黃酮類成分的研究[J]．中藥材，2006，29(11):1 187 －1 188．

[6]季 憶，陳建真，陳建明．枳殼黃酮類成分的研究進(jìn)展[J]．中國中醫(yī)藥信息雜志，2010，17(11):105 －107．

[7]國家藥典委員會(huì)．中華人民共和國藥典(一部)[M]．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:229－230．

[8]張冬松，高慧媛，吳立軍．橙皮苷的藥理活性研究進(jìn)展[J]．中國現(xiàn)代中藥，2006，8(7):25 －27．

[9]Funaguchi N，Ohno Y，La BL，et al．Narirutin inhibits airway inflammation in an allergic mouse model[J]．Clin Exp Pharmacol Physiol，2007，34(8):766－770．