電噴霧離子阱質譜檢測亮菌甲素琥珀酸單酯的負離子裂解途徑＊

陳琴華 ，朱 軍 ，李 鵬

(1．湖北醫藥學院附屬東風醫院藥學部，湖北 十堰 442008; 2．湖北醫藥學院藥物分析與篩選研究所，湖北 十堰 442008)

亮菌甲素是一種香豆素類化合物，是從假密環菌中提取的有效成分之一，臨床研究表明其具有降酶、退黃的作用，療效和安全性較好[1－2]。其在水中幾乎不溶，為滿足臨床用藥需求，常需加丙二醇、聚乙二醇、吐溫等增溶劑以提高溶解度。增溶劑的加入或使用不當常會引起毒副作用，降低藥物的安全性。亮菌甲素琥珀酸單酯(ArAAE)是采用前藥的設計方法，用琥珀酸酐將其結構中的羥甲基酰化制成琥珀酸單酯，大大改善了其水溶性[3]。高效液相色譜－質譜法(HPLC－MS)是近年來迅速發展的一項在線分離和檢測的高靈敏度、高專屬性、快速簡便的分析技術，適用于生物樣品的定性和定量分析，是藥物代謝物結構分析最有效的測定方法之一，其定量分析方法絕大多數均選擇離子檢測，必須弄清楚被測化合物的裂解碎片[4－5]。先前為了探討ArAAE的結構及其裂解途徑，在正離子模式下建立了ArAAE的質譜裂解行為，并歸屬其主要特征碎片離子[2]。后來發現，ArAAE在負離子模式下測定其檢測限更好。因此，本試驗在負離子模式下對ArAAE進行質譜研究，為進一步研究ArAAE的體內作用過程與結構修飾提供試驗依據。

1 材料與方法

1．1 藥品與試劑

亮菌甲素琥珀酸單酯[ArAAE，化學名為4－(3－乙酰基－7－羥基 －2－氧代－2H－色烯－5－基)甲氧基－4－氧代丁酸，本實驗室合成，批號為20090422，純度為99．6%]，化學結構式(M1)如圖1;甲醇(色譜純，美國Fisher公司);水由Milli－Q水純化系統制備。取適量樣品，用甲醇配制成質量濃度為0．5 mg/mL的待測溶液。

1．2 儀器與ESI-MSn分離條件

Agilent 1100型液相色譜－質譜聯用儀(美國Agilent公司)，包括電噴霧離子化源(ESI)、LC/MS trap software 4．2工作站、Data Analysis version 2．2數據處理系統，并配有直接進樣用注射泵和250 μL進樣器，具有軟電離和多級離子阱質譜功能。

1．3 方法

負離子檢測，毛細管電壓4 500 V，霧化器壓力10 Psi，干燥器溫度350℃，干燥器流速5 L/min，碰撞氣為氦氣，檢測方式為MSn(n=1～4)全掃描質譜，質量掃描范圍m/z100～500，蠕動注射泵直接進樣，溶液流速300 μL/h。

2 結果與分析

2．1 ArAAE負離子模式下的ESI-MS和ESI-MS2質譜特征

ArAAE的ESI－MS質譜圖見圖1，可見ArAAE在負離子檢測方式下易失去1個H－，形成準分子離子m/z333[M－H]－，且豐度較大。這表明在負離子模式下，ArAAE準分子離子ESIMS是以 [M－H]－存在且離子穩定性較好。

進一步對準分子離子m/z333[M－H]－進行二級掃描，ESI－MS2掃描質譜圖質譜圖見圖2，出現m/z233碎片離子，其結構為M2(圖2)。從圖1和圖2可以看出，兩個離子強度分別為3．4×107和 3×107，說明 ESI－MS2豐度與 ESI－MS 的豐度相當，提示可選用m/z333＞233作為監測子離子進行ArAAE定量測定。ArAAE的裂解途徑見圖3。

準分子離子m/z333[M－H]－在離子肼里，以He作為碰撞氣進行碰撞誘導解離，主要發生以下裂解途徑:準分子離子m/z333[M－H]－從從酯鍵發生α裂解，產生一個豐度較高的碎片離子，即m/z233[M2]－碎片離子。

2．2 ArAAE的ESI-MS3和ESI-MS4質譜特征

圖1 ArAAE的分子結構式(M1)和ESI－MS質譜圖

圖2

圖3

在多級質譜分析中，對子離子譜影響最大的是碎裂振幅。如果碎裂振幅太高，母離子完全碎裂;如果碎裂振幅太低，母離子沒有碎裂或子離子碎片過少，不便對化合物進行結構鑒定。對選定的ESI－MS2母離子m/z233逐漸加大碎裂振幅，比較不同碎裂振幅的多級質譜圖，選擇最佳的多級質譜分析條件，得到包含ESI－MS2母離子在內的結構信息，其碎片離子見圖4A。主要產生m/z分別為 215，203，189，177，171，163，147 和 135 的 8 種豐度較大的碎片離子。進一步對3種豐度較大的碎片離子m/z203，189和163進行碎裂振幅，得出這3種ESI－MS4的質譜圖分別見圖 4 B(m/z203)、4 C(m/z189)和 4 D(m/z163)，其裂解圖見圖 5，m/z203，189 和 163 分子結構式分別為 M3、M4和 M5。M2主要有以下裂解途徑:1)，從m/z203 ESI－MS4質譜圖可看出其主要裂解為2個碎片離子，即M2失去一分子甲酰基(CH2O)，產生碎片離子m/z203(M3)，M3可進一步裂解而產生m/z161和135的碎片離子;2)，由m/z189質譜圖可看出在He的碰撞下，產生了m/z171，159和147的3個主要碎片離子，從裂解途徑可推斷出是由M2失去一分子CO2，產生成m/z189(M4)的碎片離子，M4失去一分子H2O產生m/z171的碎片離子，失去一分子CH2O產生碎片離子m/z159，而失去一分子C2H2O而產生m/z147的碎片離子;3)M2失去一分子H2O形成m/z215的碎片離子，M2產生m/z163的碎片離子，進一步失去一分子H2O產生m/z145的碎片離子。從以上分析結果可見，ArAAE的裂解碎片離子見表1所示。

3 討論

20世紀20年代，質譜技術已經廣泛應用于分析領域。到了20世紀80年代，隨著快原子轟擊(FAB)、電噴霧(ESI)和基質輔助激光解析電離(MALD I)等軟電離技術的出現，質譜的分析性能得到了極大提高，離子阱質譜儀是目前較成熟的質譜儀之一，其主要優點是在一級質譜(MS)條件下獲得很強的待測物準分子離子峰，幾乎不產生碎片離子，并且可借MSn(n=2～10)對準分子離子進行多級裂解，進而獲得豐富的結構信息[6－7]。

圖4 m/z 217(A)ESI－MS3質譜圖和 m/z 203(B)、m/z 189(C)和 m/z 163(D)ESI－MS4質譜圖

圖5 ArAAE的ESI－MS3和ESI－MS4裂解途徑

本研究中采用電噴霧電離質譜(ESI－MS)技術，對ArAAE進行質譜研究，并歸屬其主要特征碎片離子。可以看出，ArAAE的ESI－MS和ESI－MS2均只有1種主要的碎片離子，表明其一級準分子離子和二級碎片離子均較穩定，可以用母離子m/z333的子離子m/z233來進行藥材含量測定。比較發現，其靈敏度在負離子模式下S/N更高，故提示負離子模式更加適合ArAAE藥物代謝動力學的測量。ESI－MS3主要有3種裂解方式，主要產生m/z203，189和163這3種碎片離子，對其進行了 ESI－MS4測定，明確了其特征碎片離子的歸屬，為進一步研究ArAAE體內代謝過程與結構修飾提供試驗依據。

表1 ArAAE的分子離子和碎片離子

[1]王 萍，葉 峰，劉 映，等．亮菌甲素治療黃疸型肝炎臨床觀察[J]．現代醫藥衛生，2007，23(17):2 554 －2 555．

[2]陳琴華，李 鵬，李春鋼．亮菌甲素琥珀酸單酯的正離子電噴霧離子阱質譜裂解途徑的研究[J]．新鄉醫學院學報，2011，28(5):566－568．

[3]陳琴華，Stefanie Weibig，羅尚文，等．HPLC－MS法同時測定5種抗癲癇藥的血藥濃度[J]．中國科學:化學，2010，40(6):762－767．

[4]Chen QH，Luo SW，Zhang YL，et al．Development of a liquid chromatography－mass spectrometry method for the determination of ursolic acid in rat plasma and tissue:Application to the pharmacokinetic and tissue distribution study[J]．Anal Bioanal Chem，2011，399:2 877 － 2 884．

[5]李 鵬，李春鋼，朱 瑜，等．反相高效液相色譜法測定亮菌甲素琥珀酸單酯注射液含量[J]．醫藥導報，2009，28(11):1 493－1 494．

[6]陳懷俠，沈少林，韓鳳梅，等．高效液相色譜－電噴霧離子阱串聯質譜分析水蘇堿及其大鼠體內代謝物[J]．藥學學報，2006，41(5):467－470．

[7]Ma SG，Zhu MS．Recent advances in applications of liquid chromatography－tandem mass spectrometry to the analysis of reactive drug metabolites[J]．Chem － Biol Inter，2009，179:25 － 37．