喜炎平注射液細菌內毒素檢查法的建立

吳寒寅，孟德勝

(中國人民解放軍第三軍醫大學第三附屬醫院野戰外科研究所藥劑科，重慶 400042)

喜炎平是穿心蓮內酯的提取物，可清熱解毒、抗病毒，且療效確切、副作用小，目前廣泛應用于治療上呼吸道感染[1]。其質量標準規定采用家兔進行熱原學檢查[2]，但該法操作煩瑣，對實驗動物要求較高，檢測費用大。本試驗根據2010年版《中國藥典(二部)》[3]和2010年版《中國藥品檢驗標準(操作規程)》細菌內毒素檢查法[4]進行試驗，建立喜炎平注射液的細菌內毒素檢查法。

1 儀器與試藥

XW－80A型渦輪混合器(上海醫科大學儀器廠);BHW－2型恒溫水浴鍋(北京醫療設備廠);微量移液器(上海求精生化試劑儀器有限公司，50 ～250 μL，200 ～1 000 μL)。細菌內毒素工作標準品(批號為080301，規格為10 EU/支);細菌內毒素檢查用水(WBET，批號為100602，規格為5 mL/支，細菌內毒素含量低于0．015 EU/mL，生產廠家為廈門鱟試劑廠有限公司);鱟試劑(TAL，批號為 1006251，靈敏度為 0．125 EU/mL，規格為 0．1 mL，湛江安度斯生物有限公司);鱟試劑(TAL，批號為100406，靈敏度為 0．125 EU/mL，規格為 0．1 mL，廈門鱟試劑廠有限公司)。喜炎平注射液(規格為 2 mL∶50 mg/支，批號分別為 20091203，20100603，20100628，江西青峰藥業有限公司)。

2 方法與結果

2．1 TAL靈敏度復核

按2010年版《中國藥典(二部)》附錄“細菌內毒素檢查法”規定，進行TAL的標示靈敏度復核，結果見表1。兩批鱟試劑靈敏度的測定值(λc)均在 0．5 λc～2．0 λc之間，表明鱟試劑靈敏度符合復核規定，可以用于細菌內毒素檢查。

2．2 細菌內毒素限值(L)的確定

根據細菌內毒素限值(L)=K/M，式中M為人用每千克體重每h最大劑量，按藥品說明書規定，可知其最大用量為500 mg(20 mL)/次，每日 1 次，則M=20 mL/60 kg·h=0．33 mL/kg·h，L=5 EU·kg－1·h－1/0．33 mL·kg－1·h－1=15 EU/mL，根據《中國藥典》[4]，適當調整限值，即提高到計算限值的2～3倍，最終確定細菌內毒素限值為5 EU/mL。

表1 TAL靈敏度復核試驗結果

2．3 最大有效稀釋倍數(MVD)確定

MVD=CL/λ =5/0．125=40倍。

2．4 供試品干擾預試驗

干擾預試驗:為確定喜炎平注射液對細菌內毒素檢查法不造成干擾的濃度，在干擾試驗前首先進行干擾預試驗。用BET水將喜炎平注射液稀釋成 1 ∶5，1∶10，1 ∶20，1 ∶40，將此 4 個濃度的供試品和原液共5個梯度濃度作為NPC系列;同時在每個濃度中加入2．0 λ的內毒素標準品做PPC系列，每一濃度平行做2支。另取2支加入BET水作為陰性對照，2支加入2．0 λ濃度的內毒素標準溶液作為陽性對照，結果見表2。可知，喜炎平注射液稀釋到40倍時，對鱟試劑與內毒素的反應無干擾，為進一步驗證，進行如下正式干擾試驗。

表2 樣品干擾預試驗結果

調pH后的干擾預試驗:將喜炎平注射液用0．1 mol/L NaOH調 pH 至適合反應的最佳 pH 范圍 6．0～8．0，其他操作按 2．4．1項下方法進行，結果表明，喜炎平注射液經用0．1 mol/L NaOH調pH至6．0～8．0后細菌內毒素試驗結果與調pH前相同。

2．5 正式干擾試驗

正式干擾試驗:將3批喜炎平注射液用細菌內毒素檢查用水進行稀釋，使其最終稀釋倍數為40倍，使用2個廠家靈敏度均為0．125 EU/mL的鱟試劑。將供試品稀釋液和BET水將同一支細菌內毒素工作標準品，稀釋制成含細菌內毒素工作標準品2．0，1．0，0．5，0．25 λ 4 種濃度的內毒素溶液。每一濃度平行做 4 管，另取BET水和供試品稀釋液各2支陰性對照管。結果見表3。可知，當喜炎平注射液稀釋至40倍時，最大濃度2．0 λ管均為陽性，最低濃度0．25 λ管均為陰性，陰性對照管均為陰性。其Es=antilg(∑X/4)=0．125 EU/mL，Et測定值均在 0．5Es～2．0Es，故喜炎平注射液稀釋至40倍后對細菌內毒素檢查法不形構成干擾。

調pH后的正式干擾試驗:取喜炎平注射液經用0．1 mol/L NaOH 調 pH 至 6．0～8．0后其他操作按 2．5．1項下方法進行，結果表明，喜炎平注射液經用0．1 mol/L NaOH調pH至6．0～8．0后，反應結果與調pH前一致。

表3 干擾試驗結果

2．6 樣品細菌內毒素檢查

取3批喜炎平注射液，分別稀釋至40倍，使用2個廠家靈敏度為0．125 EU/mL的鱟試劑按2010年版《中國藥典(二部)》附錄進行細菌內毒素檢查試驗，結果見表4。可知，供試品管和陰性對照管均呈陰性，供試品陽性對照和陽性對照管均呈陽性，3個批號供試品細菌內毒素檢查均符合規定。

表4 樣品細菌內毒素檢查結果

3 討論

細菌內毒素檢查法最適宜的pH為6．0～8．0，雖然TAL有一定的緩沖能力，但對pH過高或過低的溶液緩沖能力有限，都將影響TAL靈敏度及內毒素的活性，可能是導致試驗結果重現性差的重要原因，而在樣品中加入確定量的酸堿預先中和后再稀釋，可減少干擾。由本試驗可知，將喜炎平注射液稀釋至40倍(質量濃度為1．25 g/L)時，樣品對細菌內毒素檢查法不構成干擾，用標示靈敏度為0．125 EU/mL的鱟試劑可用于樣品的細菌內毒素檢查。該方法操作簡單、安全可靠。在干擾試驗前增加干擾預試驗，是為了初步判斷喜炎平注射液對細菌內毒素檢查法不構成干擾的稀釋倍數，如果預試驗在40倍稀釋是無法排除干擾，則應該考慮使用更高靈敏度的鱟試劑，進行更大倍數稀釋進行試驗。

[1]李曉菊，季紅英．中藥注射劑喜炎平的不良反應12例臨床分析[J]．中外醫療，2009(34):107．

[2]WS－108637W(ZD－0863)－2002，國家食品藥品監督管理局標準(試行)[S]．

[3]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(二部)[M]．北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄ⅪE，附錄ⅩⅨM．

[4]周國斌．《中國藥品檢驗標準(操作規程)》[M]．北京:中國衛生出版社，2010:330－343．