銀杏葉提取物對高同型半胱氨酸血癥vWF、Ps、FIB影響的實(shí)驗(yàn)研究

馬壽宏，頊志兵，羅霜梅，朱 勣，祈麗麗，吳 祎

（1.云南省通海縣中醫(yī)院，云南通海652700； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海200434）

動脈粥樣硬化的發(fā)展是一個復(fù)雜過程，起始于動脈內(nèi)皮功能異常，高同型半胱氨酸血癥為其觸發(fā)因素。大量基礎(chǔ)和動物實(shí)驗(yàn)的表明同型半胱氨酸血癥（Hcy）可能通過內(nèi)皮損傷和內(nèi)皮功能異常，刺激血管平滑肌細(xì)胞增生，破壞機(jī)體凝血和纖溶的平衡，使機(jī)體處于血栓前狀態(tài)，從而增加了心血管疾病發(fā)病的危險(xiǎn)性。本文旨在通過研究銀杏葉提取物對高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，HHcy）動物模型血漿Von willebrand′s factor（vWF）、FIB（Fibrinogen）、Ps（P-selectin）濃度、水平的干預(yù)作用，闡明銀杏葉改善血管內(nèi)皮功能的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性Wistar大鼠51只，體重（142±47）g，由中國科學(xué)院上海藥物所實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 銀杏葉膠囊（百路達(dá)），規(guī)格：0.2 g×20粒，由上海信誼百路達(dá)藥業(yè)有限公司提供，批號：031204。葉酸片，規(guī)格5 mg/片，由上海辛帕斯制藥有限公司提供，批號：080801。1%羥甲基纖維素鈉溶液（1%CMC）由中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司提供，批號：F20090626。蛋氨酸（Met）由德國德固賽公司提供，批號：15112007W1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組及給藥方法 51只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，空白對照組12只，模型組13只，葉酸組13只及銀杏葉組13只。參照王祿增［1］及Wang G P等［2］等造成大鼠HHcy模型。根據(jù)體重計(jì)算灌胃量，每周測一次體重。空白對照組予1%羥甲基纖維素鈉溶液（CMC）液2 mL灌胃，每天1次，然后給予正常飼料，共8 w。模型組予3%蛋氨酸混懸液（300 mg Met加1 mL 1%CMC液）1.5 mg/g體重灌胃，每天1次，然后給予正常飼料，共8 w。葉酸組予3%蛋氨酸混懸液加葉酸混懸液（1.2 mg葉酸加1 mL 1%CMC液）0.06 mg/g體重灌胃，每日1次，然后給予正常飼料，共8 w。銀杏葉組予3%蛋氨酸混懸液加銀杏葉混懸液（4 mg銀杏葉加1mL 1%CMC液）0.02 mg/g體重灌胃，每日1次，然后給予正常飼料，共8 w。

1.2.2 標(biāo)本采取 8 w末，所有研究對象均在確診后進(jìn)行標(biāo)本采集。空腹抽取靜脈血2 mL，分別置于不抗凝的有機(jī)玻璃管內(nèi)、含有1/10體積0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝液的試管內(nèi)、含有抑肽酶30 μL、10%乙二胺四乙酸鈉鹽（EDTA-Na）40 μL的預(yù)冷試管中，于4℃冰箱貯存，在4 h內(nèi)低溫離心（10 min，3000 r/min），收集上清液，放于-20℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 血清Hcy水平檢測 采用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）方法在上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心檢測。本方法批內(nèi)CV<8.79%，批間CV<6.87%。正常的血清Hcy空腹參考值為5 μmol/L～15 μmol/L。

1.2.4 血漿vWF、Ps檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法原理測定血漿vWF、Ps水平。試劑由上海太陽生物技術(shù)公司提供，批號：MB0801，使用SPECTRA max PLUS 384酶標(biāo)儀測定。

1.2.5 血漿FIB檢測 采用免疫濁度法，F(xiàn)IB試劑盒由上海太陽生物技術(shù)公司提供，使用UNICO UV 2000紫外可見光光度計(jì)進(jìn)行測定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

各組血清Hcy水平、血漿vWF、Ps、FIB水平比較，結(jié)果見表1。

表1 各組血清Hcy水平、血漿vWF、Ps、FIB水平的比較 （±s）

表1 各組血清Hcy水平、血漿vWF、Ps、FIB水平的比較 （±s）

注:與模型組比較，1）P<0.05，2）P<0.01

組別 n H c y（μ m o l/L） v W F（%) P s（n g/m L) F I B（g/L)空白對照組 10 8.12±2.78 2） 3.55±2.10 2） 0.32±0.06 2） 0.58±0.37 2）模型組 11 100.47±41.68 6.75±2.10 0.47±0.13 1.06±0.41銀杏葉組 11 78.27±22.09 1） 4.30±2.00 1） 0.37±0.06 1） 0.64±0.38 2）葉酸組 11 33.34±24.61 2） 4.50±2.84 1） 0.36±0.06 1） 0.80±0.37 2）

從表1可以看出，模型組血清Hcy水平，血漿vWF、Ps、FIB 水平明顯高于空白對照組（P<0.01）。用藥后葉酸組、銀杏葉組血清Hcy水平，血漿vWF、Ps、FIB水平較模型組明顯降低，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05）。用藥后銀杏葉組血漿vWF、Ps水平與葉酸組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討 論

大量研究證實(shí)，Hcy升高與心血管疾病有關(guān)，是心血管疾病的一個獨(dú)立危險(xiǎn)因素［3-6］。基礎(chǔ)和動物實(shí)驗(yàn)的研究表明，Hcy可能通過以下機(jī)制引起動脈粥樣硬化和血栓形成。（1）內(nèi)皮毒素作用：包括自身氧化作用、血管內(nèi)皮功能紊亂及改變內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［7-8］。（2）刺激血管平滑肌細(xì)胞增生：平滑肌細(xì)胞增殖是AS形成過程中的中心環(huán)節(jié)。Hcy可直接誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖和膠原的合成［9-11］。Hcy能夠增強(qiáng)平滑肌細(xì)胞內(nèi)NF-κB介導(dǎo)的誘生型一氧化氮合酶（iNOS）的合成，促進(jìn)合成NO。過量的NO促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞從收縮型逆分化為合成型，從而導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞增生［12］。（3）致血栓作用：Hcy 可導(dǎo)致凝血參數(shù)的異常升高，如VIII因子、vWF、FIB、Ps等［13］。Hcy損傷冠狀動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞引起凝血酶的產(chǎn)生和vWF釋放增加，vWF促進(jìn)血小板黏附、聚集和血栓形成。

Ps既是內(nèi)皮損傷的一個指標(biāo)，又是血小板活化的特異性指標(biāo)。Ps介導(dǎo)血小板黏附于內(nèi)皮細(xì)胞及血小板－中性粒細(xì)胞、血小板－單核細(xì)胞連接，啟動血栓形成過程［14-15］。馮維爾布蘭德因子（Von willebrand′s factor，vWF，血管性血友病因子）由血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞合成分泌的一種多聚糖蛋白，vWF水平在某種程度上反映了內(nèi)皮細(xì)胞的功能狀態(tài)和結(jié)構(gòu)完整與否。通過其配體糖蛋白Ib（GPIb）和糖蛋白IIb／IIIa介導(dǎo)血小板黏附和聚集，形成穩(wěn)定的血小板纖維蛋白血栓。FIB水平增高可加速動脈粥樣硬化損傷及血栓形成［16］。

本實(shí)驗(yàn)觀察到模型組血清Hcy較空白對照組明顯升高（P<0.05），血漿 vWF、Ps、FIB 水平也較空白對照組升高（P<0.05）；且血清Hcy水平與血漿 vWF、Ps、FIB 呈正相關(guān)（P<0.05），與文獻(xiàn)報(bào)道相似［2，16］，進(jìn)一步證實(shí)了過量的蛋氨酸可造成HHcy，HHcy可造成內(nèi)皮功能紊亂，血漿vWF、Ps、FIB水平升高，血液處于血栓前狀態(tài)，促使動脈粥樣硬化和血栓形成。

晚近國內(nèi)外對銀杏葉提取物（GBE）的有效成分的活性及作用機(jī)制做了大量的基礎(chǔ)和動物實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)銀杏葉具有廣泛的藥理作用，如拮抗血小板活化因子、抗氧化作用、清除自由基、改善血管內(nèi)皮舒縮功能、減輕平滑肌細(xì)胞的增殖，影響離子通道和信號傳導(dǎo)、擴(kuò)張血管，降血脂，改善血液流變學(xué)等作用［17-18］。

本研究觀察GBE降低血清Hcy水平的作用，結(jié)果顯示模型組血清Hcy水平較空白對照組升高（P<0.05）。用藥后葉酸組、銀杏葉組血清Hcy水平明顯降低，與模型組比較有明顯差別（P<0.05），表明GBE有降低血清Hcy水平的作用。

觀察GBE對HHcy血漿vWF、Ps、FIB水平的影響，結(jié)果顯示模型組血漿vWF、Ps、FIB水平明顯高于空白對照組（P<0.01）。用藥后銀杏葉組、葉酸組血漿vWF、Ps、FIB水平降低，與模型組比較有顯著性差異（P<0.05）。研究表明GBE可能通過降低HHcy血漿vWF、Ps、FIB水平，降低血液黏度，減少血栓形成，改善血管內(nèi)皮功能，延緩動脈粥樣硬化的進(jìn)程和血栓形成。

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