天花粉降糖作用有效部位的研究

李 瓊，葉小利，陳 新，黃 靜，李學剛*,3

(1.西南大學藥學院，重慶 400715；2.西南大學生命科學學院，重慶 400715；3.重慶市藥效學評價工程中心，重慶 400715)

天花粉為葫蘆科植物栝樓TrichosantheskirilowiiMaxim.或雙邊栝樓TrichosanthesrosthorniiHerms的干燥根，又名栝樓根，花粉、栝蔞粉，蔞粉等。其用藥最早見于《神農本草經》,主治熱病口渴、消渴(糖尿病)、黃疸、肺燥咳血、癰腫、痔痿[1]。現代藥理研究[2]發現,天花粉具有致流產、抗早孕、抗癌、抗菌、抗病毒等作用。關于糖尿病的治療作用并不多，根據目前文獻報道，天花粉提取物及復方對于改善糖尿病及其并發證的各種癥狀具有明顯效果[3-4]，而發揮降糖作用的有效部位及有效成分尚未見報道。本文采用人肝癌細胞HepG2和糖尿病小鼠模型,對天花粉醇提物和水提物降糖作用進行研究，為進一步的開發天花粉藥理作用提供實驗依據。

1 材料

1.1 藥材和試劑 天花粉購于重慶市康源大藥房，經西南大學藥學院李學剛教授鑒定為葫蘆科植物栝樓的干燥根，鹽酸二甲雙胍片為湖北午時藥業股份有限公司產品(批準文號H20052404)；RM1640培養基購自Gibico公司，HepG2細胞購自北京軍工所，胎牛血清購自Gibico公司，胰酶購自Sigma公司；葡萄糖試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20100819)，SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號為20100919)，MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號為20101201)，2,7-Dichloro-dihydrofluoresce-diacetateDCFH-DA購自Sigma公司；四氧嘧啶購自Sigma公司，化學試劑均為分析醇。

1.2 動物 SPF級KM雄性小鼠，體質量(20±2)g，購自重慶醫科大學實驗動物中心,動物許可證號：SCXK(渝)20070001。飼養在室溫(23±2) ℃，相對濕度40%～60%條件下，自由進食飲水，實驗前穩定3 d。

糖尿病小鼠模型：平衡喂養3 d，禁食不禁水，12 h 后，尾靜脈注射四氧嘧啶65 mg/kg，72 h后取血測定小鼠血糖，血糖值>11 mmol/L的小鼠為糖尿病模型小鼠。

1.3 儀器 酶標儀(BioTek)，二氧化碳培養箱(Thermo)，全自動生化分析儀(EOS bravo Plus)，紫外分光光度計(UV1800)，真空冷凍干燥機(北京長流科學儀器公司)。

2 方法

2.1 天花粉提取物的制備 天花粉粉碎，準確稱取4 000 g，用5倍量85%乙醇超聲提取2 h，過濾，提取3次，濾液合并濃縮得85%乙醇提取物。提取物用水混懸后，分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得石油醚提取物(組分Ⅰ)、乙酸乙酯提取物(組分Ⅱ)，正丁醇提取物(組分Ⅲ)。

準確稱取天花粉1 000 g，加1 000 mL的PBS緩沖液(pH 7.2)于4 ℃冰箱中攪拌浸提24 h，用紗布過濾，濾渣棄掉，得濾液總體積1 050 mL，于4 ℃條件下10 000 r/min離心20 min。棄去沉淀，收集上清液，凍干，得蛋白提取物(組分Ⅳ)。

2.2 天花粉提取物促進HepG2細胞葡萄糖吸收[5]HepG2細胞復蘇后用含10%滅火的小牛血清的RM1640培養基轉入100 mL培養瓶中，在37 ℃，5%CO2條件下培養。當細胞貼壁長滿后，傾去培養基，用0.25%胰蛋白酶消化，每3 d按1∶3比例傳代1次，取對數生長期的細胞用于實驗。

將HepG2細胞用含10%小牛血清的RM1640培養基轉入48孔板中,每孔加300 μL。待細胞長至80%～90%融合后，把48孔板中的培養基更換無血清的培養基,每孔225 μL。將細胞分為空白組，二甲雙胍組，藥物組(組分Ⅰ，組分Ⅱ，組分Ⅲ，組分Ⅳ)，各給藥組根據預試驗結果分別在半數抑制濃度可能的濃度范圍附近設置3個給藥濃度，分別為100 mg/L、10 mg/L和1 mg/L，每個藥物每個劑量設置3個平行，每孔25 μL。PBS緩沖液為空白對照。培養24 h后，每孔取出115 μL培養液于全自動生化分析儀的樣品杯中，待檢測。

促進葡萄糖吸收率(%)=(原培養基中葡萄糖量-藥物組培養基中剩余葡萄糖量)×100%/(原培養基中葡萄糖量-空白對照培養基中葡萄糖量)

2.3 天花粉各組分對糖尿病小鼠血糖的影響[5-6]取糖尿病小鼠，隨機分為6組，每組10只。組分Ⅰ(100 mg/kg)、組分Ⅱ(100 mg/kg)、組分Ⅲ(100 mg/kg)和組分Ⅳ(100 mg/kg)，高糖對照組灌胃蒸餾水，陽性對照組灌胃二甲雙胍片(100 mg/kg)。連續灌胃15 d，每日1次。第16天，禁食不禁水12 h后，尾靜脈取血測定空腹血糖。

3 結果

3.1 天花粉提取物的制備結果 見表1。

表1 天花粉各組分的提取結果

天花粉用85%乙醇超聲提取后，所得總浸膏222 g。由表1可以看出，天花粉醇提物經萃取后有一半的組分仍留在水相中，相比之下，正丁醇部位(組分Ⅲ)收率最高，其次是石油醚部位(組分Ⅰ)，最低的是乙酸乙酯部位(組分Ⅱ)；天花粉用PBS緩沖溶液提取所得的蛋白提取物收率為0.64%。

3.2 天花粉各組分對HepG2細胞消耗葡萄糖的影響 見表2。

表2 天花粉各組分對HepG2細胞消耗葡萄糖的影響±s，n=3) mmol/L

表2結果所示,天花粉水提Ⅳ組分具有明顯促進肝癌細胞吸收葡萄糖的作用，在相同給藥劑量5 mg/L時，接近于二甲雙胍；在相同濃度下，組分Ⅳ促進細胞消耗葡萄糖能力最強，石油醚、乙酸乙酯部位次之，正丁醇部位最弱。

3.3 天花粉各組分對四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的影響 見表3。

表3 天花粉各組分對四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的影響±s，n=10) mmol/L

表3結果所示，組分Ⅳ的降糖作用最強，結果與細胞實驗的結果類似。故組分Ⅳ是天花粉的有效降糖部位。

4 討論

細胞降糖實驗和動物實驗的結果均表明，天花粉水提部位的降糖效果最好，石油醚、乙酸乙酯部位次之，正丁醇部位最弱。與有關文獻[5]報道類似。糖尿病日久,會出現陰損及陽，陰陽俱虛或久病入絡，血脈瘀滯，影響氣血的正常運行，且陰虛內熱，耗傷津液亦使血行不暢，而至血脈瘀滯，引發各種并發證[7-8]。隨著人們生活水平的提高，糖尿病人群不斷增加，天花粉具有確切的降糖作用。本實驗利用肝癌細胞消耗葡萄糖模型和四氧嘧啶糖尿病小鼠模型結合提取分離手段，最終找出天花粉中降血糖的活性部位為天花粉凝集素蛋白部分。今后應對該部位進行成分研究，以促進天花粉的開發利用。

[1]中華人民共和國藥典委員會.中國藥典[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010:52-53.

[2]李時珍.本草綱目[M].北京:人民衛生出版社,1957:1018.

[3]南國柱,裴元靜,蔣國彥,等.栝樓根(天花粉)降血糖作用研究[J].藥學學報,1959,7(1):43-44.

[4]仇偉欣.天花粉藥理學研究進展[J].中國中醫藥信息雜志,1996,3(6):11-13.

[5]朱家穎,岑曉鳳,陳星,等.黃連生物堿降糖活性協同作用研究[J].時珍國醫國藥,2010,21(9):2282-2284.

[6]吳建霞,郭利平,王婕.中藥及其有效成分降糖作用機制的研究進展[J].吉林中醫藥,2010,30(2):181-182.

[7]蘇秀海,孫文亮,李寶芬,等.復榮通脈膠囊治療糖尿病周圍血管病變76例臨床研究[J].河北中醫,2006,28(1):13-15.