去卵巢對Wistar大鼠MSCs的形態學、生長曲線及骨/脂向分化能力的影響

王 艷，李遇伯，李 晶，周 鵬，畢月玲，陳學艷

(1.天津中醫藥大學中藥學院 天津市中藥化學與分析重點實驗室，天津 300193；2.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193)

骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是在骨髓中發現的一種起源于中胚層，具有自我復制和多向分化潛能的非造血干細胞[1]。其在不同的誘導條件下,能分化成成骨細胞[2]、軟骨細胞[3]、脂肪細胞[4]等中胚層組織。越來越多的研究發現各種原因(如衰老、骨質疏松)引起的骨量減少往往是和骨髓中的脂肪組織增多伴行的，因此人們開始關注MSCs參與的成骨減少和成脂肪增多所引起的骨質疏松[5]。本實驗采用雙側卵巢切除法復制骨質疏松癥(osteoporosis,OP)大鼠模型，比較了正常和OP大鼠MSCs的形態學、生長曲線、骨向和脂向分化能力的差異，從MSCs角度闡釋OP后機體內的病理學變化，為以MSCs為平臺，研究OP提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 6月齡雌性Wistar大鼠(中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供)。

1.2 主要試劑 α-MEM培養基(Gibeo)，胎牛血清(Hyclone)，胰蛋白酶、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、噻唑蘭(MTT)(上海生工)，地塞米松、β-甘油磷酸鈉、VitC、吲哚美辛、牛胰島素、異丁基黃嘌呤(Sigma)，巴比妥鈉、油紅O染料(北京索萊寶)，Ficoll(GE Healthcare)。

1.3 誘導液配制

1.3.1 成脂誘導液 α-MEM+10 mL/dL胎牛血清(含100 U/mL青、鏈霉素)+10 μmol/L胰島素+1 μmol/L地塞米松+0.5 mmol/L異丁基黃嘌呤(IBMX)+100 μmol/L吲哚美辛。

1.3.2 成骨誘導液 α-MEM+10 mL/dL胎牛血清(含100 U/mL青、鏈霉素)+0.1 μmol/L地塞米松+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉+50 μmol/L維生素C。

1.3 主要儀器 CO2培養箱(Thermo)，TS100型倒置相差顯微鏡(NiKon)，超凈工作臺(蘇州佳寶凈化)，TECAN infinite M200型酶標儀(TECAN)。

2 方法

2.1 動物模型與分組 12只6月齡Wistar雌性大鼠隨機分成模型組和假手術組，每組6只，模型組雙側卵巢切除法復制大鼠OP模型，假手術組大鼠找到卵巢后不切除。術后連續肌注青霉素3 d，5萬U/只。普通飼料飼養，自由飲水，增齡3個月。

2.2 MSCs的分離與培養 大鼠麻醉后頸椎脫臼處死，無菌條件下剝離脛、股骨，用完全培養液反復沖洗骨髓腔，所得單細胞懸液接種于塑料培養瓶中培養。原代MSCs培養7～10 d后傳代，之后培養3～5 d按1∶2比例傳代。

2.3 MSCs細胞表面標志物的鑒定 取P3代MSCs，經0.25%胰酶+0.02%EDTA消化后，制成單細胞懸液。以3×104Cells/mL接種于6孔板中。2 d后取出，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌3次，山羊血清37 ℃孵育30 min，加入一抗4 ℃孵育過夜，選用非相關IgG抗體作為陰性對照。PBS洗滌3次后，加入二抗37 ℃孵育60 min，PBS洗3次，SABC反應液37 ℃孵育60 min，PBS洗3次，DAB顯色后立即于顯微鏡下觀察。蒸餾水洗，蘇木素復染，脫水，透明，封片。

2.4 正常與OP大鼠MSCs生物學特性的比較

2.4.1 形態學 采用倒置相差顯微鏡，觀察并比較正常與OP大鼠MSCs的形態學差異。

2.4.2 MTT法檢測生長曲線 分別取正常與OP大鼠P3代MSCs，以2.0×103cells/mL接種到96孔板中，每孔終體積200 μL，從接種后的第1天起進行MTT測定，每天測1板。均設6個復孔。各組同時培養達4 h后，測定各孔吸光度值。測量波長為570 nm。

2.5 有及無誘導條件下正常與OP大鼠MSCs多向分化能力的比較

2.5.1 分組 正常組(正常大鼠MSCs未加誘導條件)，OP組(OP大鼠MSCs未加誘導條件),正常誘導組[正常大鼠MSCs+成骨(成脂)誘導液]，OP誘導組[OP大鼠MSCs+成骨(成脂)誘導液]。

2.5.2 骨向分化ALP染色比較 正常及OP大鼠P3代MSCs分別以1×105Cells/mL接種于預先置有無菌蓋玻片的6孔板中，按2.5.1分組，分別培養。14 d后取出相應玻片進行ALP染色，光鏡下觀察，比較。

2.5.3 脂向分化油紅O染色比較 正常及OP大鼠P3代MSCs分別以1×105Cells/mL接種于預先置有無菌蓋玻片的6孔板中，按2.5.1分組，分別培養。18 d后取出相應玻片進行油紅O染色，光鏡下觀察，比較。

3 結果

3.1 免疫組化染色檢測MSCs表面抗原 免疫組化染色鑒定結果顯示MSCs細胞呈CD29、CD44陽性，胞漿染色呈棕黃色(圖1、2)；CD34、CD45陰性(圖3、4)。

圖1 CD29

圖2 CD44

圖3 CD34

圖4 CD45

3.2 正常與OP大鼠MSCs形態學觀察 采用倒置相差顯微鏡觀察2組細胞的生長狀態,經傳代，正常大鼠MSCs還呈比較典型的集落方式生長，細胞為長梭形(圖5a)。而OP大鼠MSCs的增殖速度減慢，細胞形態寬大、扁平，可見少量脂肪細胞(圖5b)。

3.3 正常與OP大鼠MSCs生長曲線 從圖6可以看出，接種后所測得的生長曲線均呈S形。細胞接種后1～4 d OD值變化不大，到第4天OD值開始明顯增加，OD值于第7天達到頂點，隨后有減小的趨勢。對比正常組與OP組大鼠MSCs生長曲線，二者增殖趨勢基本相同，且符合細胞生長規律。但是在增殖能力上OP大鼠MSCs較正常組降低，經配對樣本t檢驗，t=3.316，df=8，P=0.011<0.05，二者差異具有統計學意義。

圖5a 正常大鼠P3代第5dMSCs(100×)

圖5b OP大鼠P3代第5dMSCs(100×)

圖6 正常與OP大鼠P3代MSCs生長曲線

3.4 骨向分化ALP染色比較 骨向誘導15d后運用鈣鈷法進行ALP染色，胞漿內呈現深棕色或深黑色顆粒狀或大片狀黑色沉淀，說明MSCs成功分化為OB。且正常誘導組ALP染色陽性細胞明顯多于OP誘導組。結果如圖7a、7b所示。

圖7a 正常誘導組MSCs ALP染色(100×)

圖7b OP誘導組MSCs ALP染色(100×)

3.5 脂向分化油紅O染色比較 脂肪誘導第4天，細胞胞漿內開始出現細黃色小脂滴，逐漸融合，倒置顯微鏡下可見的高折光性的小圓形脂滴，晶瑩透亮，主要集中于細胞核周圍。隨著誘導時間的延長，出現脂滴的細胞逐漸增多。繼續誘導，胞內的小脂滴逐漸融合成大的脂滴，細胞體積逐漸增大，由原來的長梭形變為橢圓形或多角形，細胞核被被大顆粒狀的脂滴擠于一側。隨著誘導時間的延長，脂肪細胞的比例逐漸增高。油紅O染色顯示脂滴呈紅色，OP誘導組陽性數量明顯多于正常誘導組，結果如圖8a、8b所示。

圖8a 正常誘導組MSCs油紅O染色(200×)

圖8b OP誘導組MSCs油紅O染色(200×)

4 討論

MSCs可以表達多種標記，但是缺乏特異性表面標記，目前尚無具有高度特異性的MSCs表面標記物，其鑒定的方法都是通過在培養過程中出現分化表型，然后逆推得知是否為MSCs。因此本實驗選取MSCs表達陽性的指標CD29和CD44，以及表達陰性的指標CD34和CD45作為鑒定參考指標。本實驗結果與報道一致，證明分離培養擴增的為大鼠MSCs[6]。

MSCs成骨分化的主要表現是細胞能夠合成、分泌表達成骨特異性的蛋白和細胞外基質成分,包括早期出現的ALP,Ⅰ型膠原等。ALP是成骨的標志物之一，對它的測定可以反映細胞向成骨方向分化的程度。在基質開始鈣化時成骨細胞的ALP活性最高，在鈣化接近結束時,活性則最低，其活力在一定程度上反映成骨細胞的分化程度和功能狀態。因此,ALP的活性可以代表成骨細胞的早期分化水平。其作用是水解有機磷酸鹽釋放出無機磷而作用于羥基磷灰石的形成，是骨形成所必需的酶，它代表著骨形成的狀況，表明細胞分化的開始。

本研究結果表明，去卵巢對于大鼠MSCs形態及增殖能力均有一定的影響。正常大鼠MSCs呈典型的集落生長，細胞呈長梭形，傳代后增殖能力較強；而去卵巢后MSCs體積較大，細胞偏圓形，增殖能力大大下降。OP大鼠在分離完股骨和脛骨后，用PBS沖洗骨髓腔時,沖出的液體可見大量的油脂浮于表面，可推測骨髓中脂肪含量較高。在相同條件誘導下，OP大鼠MSCs更傾向于向脂肪細胞分化，而正常細胞則更多向成骨細胞分化。 綜上所述，可初步推測去卵巢，增齡會導致骨髓腔內脂肪組織增多，骨組織減少，從而造成骨質疏松。

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