針刀松解法對肩周炎家兔模型局部組織形態學及TGF-β1的影響

郭長青，馮 濤，陳幼楠，劉乃剛，袁 紅，孫紅梅，吳海霞，許 紅，韓森寧，楊淑娟

(1.北京中醫藥大學針灸推拿學院，北京 100029；2.衛生部中日友好醫院 中醫針灸科，北京 100029；3.北京中醫藥大學基礎醫學院，北京 100029)

肩周炎有著明顯的病理分期，Bunker TD[1]將其分為疼痛期、僵硬期、緩解期。徐洪璋等[2]通過對文獻的分析認為針刀可直接作用于病變局部，松解黏連,因此主要適用于肩周軟組織有明顯黏連的類型。本研究通過觀察針刀松解法對不同病理分期肩周炎家兔模型局部組織形態學、轉化生長因子β1(Transforming growth factor beta 1，TGFβ1)的影響，探討針刀松解法對肩周炎干預作用的可能機制，并探尋針刀松解法治療肩周炎的最佳介入時間，為肩周炎的針刀臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性新西蘭兔48只，兔齡(6±0.5)個月，體質量(2.5±0.5)kg，北京市海淀區興隆實驗動物養殖場提供，批號：SCXK(京)2006-0001，在北京中醫藥大學基礎醫學院實驗動物中心動物室喂養。適應性飼養3 d后隨機分為正常組、模型組、電針組、針刀A組(疼痛期干預)、針刀B組(僵硬期干預)、針刀C組(疼痛期及僵硬期均干預),每組8只。實驗過程中對動物處置符合動物倫理學要求。

1.2 主要儀器設備 0.4 mm×40 mm漢章牌Ⅰ型針刀，北京華夏針刀醫療器械廠；0.25 mm×25 mm環球牌無菌針灸針，蘇州針灸醫療器材有限公司；5415R高速離心機，德國Eppendorf公司；MDF-U50A超低溫冰箱，日本SANYO公司；FS/FAS5030石蠟切片機，德國LETIZ公司；Nikon顯微鏡，日本Nikon株式會社；ZD-9556水平搖床，江蘇太倉市實驗設備廠；SHZ-88臺式水浴恒溫振蕩器，江蘇太倉市實驗設備廠；DY89-1型電動玻璃勻漿機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 主要試劑 75%乙醇:北京海德潤制藥有限公司；碘伏消毒劑：武漢同濟美迪生科技有限公司；0.9%氯化鈉注射液：四川科倫藥業股份有限公司；水合氯醛：北京化學試劑廠；37%～40%福爾馬林液，北京北化精細化學品有限責任公司；二甲苯,北京北化精細化學品有限責任公司；石蠟，北京化學試劑公司；兔轉化生長因子β1(TGFβ1)ELISA測定試劑盒：北京尚柏恒通公司。

1.4 造模方法 參照文獻[2]的造模方法進行造模。首先用彎剪剪除兔右肩部外側約6 cm×6 cm的兔毛，然后使兔俯臥，將兩后肢和左前肢固定于兔臺，右前肢與水平搖床固定連接。以240次/min頻率、1.5 cm振幅平行搖動肩關節，每天持續4 h，連續3 d。然后將肩袖袋(自制)以水浸濕后裝冰塊(每塊3 cm×3 cm×1.5 cm，每袋每次裝4塊)外敷兔右肩部，當冰塊融化將盡時更換，每天持續4 h,連續3 d。第1次搖動兔肩關節當日記為實驗第1天。根據熊昌源等[3]的病理觀察結果確定病理分期。正常組造模期間每天固定于兔臺4 h，共6 d。

1.5 處理方法 正常組和模型組正常飼養，不做干預處理；電針組進行電針干預，在實驗第9天開始，每周3次，共治療12次；針刀A組在實驗第9、16天各進行1次針刀干預，共2次；針刀B組在實驗第23、30天各進行1次針刀干預，共2次；針刀C組在實驗第9、16、23、30天各進行1次針刀干預，共4次。

針刀方法：首先將模型兔固定，然后對患側肩部軟組織進行觸診，分別在結節間溝、大圓肌起始部、岡上肌腱與肌腹結合部3處尋找到陽性反應點后進針刀，做縱行疏通與橫行剝離2～3刀，出針刀后按壓1 min，防止出血。

1.6 取材 各組動物均于實驗第33天進行取材。首先采用10%水合氯醛按2 mL/kg體質量進行耳緣靜脈麻醉，麻醉完全后，腹主動脈取血4 mL，室溫下血液自然凝固10～20 min后，冷凍離心機離心(4 ℃，3 000 r/min，離心20 min)，取上清液,置于-70 ℃冰箱中保存待測；取血后迅速進行肩關節周圍軟組織取材，分別取肱二頭肌、岡上肌、岡下肌、大圓肌相同位置、相同大小的組織塊，將組織塊置冰面上，0.9% Nacl注射液漂洗干凈，除去血跡，濾紙吸干，稱質量，按10%的比例往組織中加入勻漿介質(由pH 7.4，0.01mol/L Tris-Hcl，0.000 1 mol/L EDTA 0.01 mol/L蔗糖,PMSF 0.1 mmol/L，BSA0.1%組成)，用眼科剪于冰水浴中剪碎組織塊，然后在冰浴中超聲勻漿30 s,之后用冷凍離心機離心(4 ℃,2 000 r/min，10 min)。取上清液,置于-70 ℃冰箱中保存待測。然后取肱二頭肌肌腱、肩關節滑膜囊，位置和大小保持一致，將組織塊放在冰面上，用0.9%氯化鈉注射液沖洗，放入20%甲醛溶液固定1周，自來水沖洗24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片(片厚6 μ),常溫保存。之后腹主動脈放血處死動物。

1.7 指標檢測 1)組織形態學觀察：組織切片進行HE染色，光鏡觀察照相。2)TGFβ1檢測：采用酶聯免疫吸附法檢測血清和局部肌肉組織勻漿中TGFβ1含量。操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

2 實驗結果

2.1 針刀松解法對兔局部組織形態學的影響 正常組(圖1，A)滑膜細胞多為1層，有些部位也可見2～3層，在皺襞較多處滑膜細胞可達5～6層。滑膜細胞深層結構疏松，可見少量毛細血管。模型組(圖1，B)滑膜細胞多為1～2層，滑膜上皮深層毛細血管較多，其內可見較多紅細胞，未見明顯炎細胞浸潤。電針組(圖1，C)、針刀A組(圖1，D)、針刀B組(圖1，E)、針刀C組(圖1，F)滑膜細胞排列基本同正常組，可見滑膜細胞多為1層，有些部位也可見2～3層，在皺襞較多處滑膜細胞可達5～6層?；ぜ毎顚咏Y構疏松，可見少量毛細血管。

正常組肌腱(圖2，A)外膜由結締組織包繞，最外層上皮細胞為立方細胞1～2層，排列整齊，腱纖維排列整齊。模型組肌腱(圖2，B)外膜上皮細胞排列不整齊，上皮細胞增多可達4～5層，上皮深層下行纖維增多，結構更加致密，其深層腱纖維排列不夠整齊。未見明顯炎細胞浸潤。電針組肌腱(圖2，C)、針刀A組(圖2，D)、針刀B組(圖2，E)、針刀C組(圖2，F)病理改變基本相同，肌腱的外膜(腱鞘臟層)上皮細胞增生，但較模型組少，多為2～3層。上皮下結締組織也較致密，其深層腱纖維排列較整齊。

2.2 針刀松解法對兔血清和局部肌肉組織中TGF-β1的影響 見表1。

3 討論

轉化生長因子β是一類有著多種生物學效應的蛋白質超家族,在哺乳動物中發現有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 3個亞型，其中TGF-β1是一種具有巨大的生物學活性的與傷口愈合有關的細胞因子，也是纖維化和瘢痕形成的病理過程中的關鍵性細胞因子[5-6]。TGF-β1可促進細胞外基質的合成，一方面TGF-β1增加細胞外基質蛋白的合成如膠原蛋白、纖黏連蛋白、糖蛋白的表達和分泌，加強細胞黏附蛋白受體的轉錄、翻譯和處理過程；另一方面減少基質降解蛋白酶的合成，增加這些蛋白酶特異抑制劑如纖維蛋白溶酶原激活抑制物與組織特異性金屬蛋白酶抑制物的合成。Rodeo SA等[7]研究表明原發性凍結肩和繼發性凍結肩患者肩關節囊中TGF-β及其受體表達均明顯升高，李宏云等[8]也發現凍結肩患者肩袖間隙組織中轉化生長因子-β mRNA和基質金屬蛋白酶表達水平均明顯升高，說明轉化生長因子-β在凍結肩的發生和發展過程中有重要作用。

表1 各組兔血清和局部肌肉組織中TGFβ1的變化±s) ng/mL

A正常組；B模型組；C電針組；D針刀A組；E針刀B組；F針刀C組

A正常組；B模型組；C電針組；D針刀A組；E針刀B組；F針刀C組

本實驗組織形態學結果表明針刀松解法能改善局部病理狀態，減少滑膜增厚和肌腱纖維增生，促進組織的修復。TGF-β1的檢測結果表明針刀松解法對模型兔血清和局部肌肉組織中異常增高的TGFβ1含量有一定的良性調節作用，可顯著降低其含量(P<0.05，P<0.01)；對血清TGF-β1的調節各治療組大致相同，未出現顯著性差異(P>0.05)，而對局部肌肉組織中TGF-β1的調節以針刀A組調節作用最優，電針組和針刀C組相當；針刀B組次之，可能與針刀B組只在僵硬期干預，治療2次后，隨即取材，針刀的作用尚未影響到局部組織中TGF-β1的含量有關。

針刀松解法是針刀醫學的一種重要操作方法，它將現代醫學的手術刀與中醫學的針灸針有機的融合為一體，在治療中既可直接作用于病變部位，發揮“刀”的松解作用，又可舒筋通絡，發揮針灸針的良性刺激作用，因此在治療慢性軟組織損傷等疾病方面臨床療效較傳統針灸更為顯著。針刀可直接作用于肩周炎病變局部的結筋病灶點，通過對病灶的切割松解，剝離局部組織的黏連，消除病灶點，恢復經筋的正常功能，達到治療目的。本實驗結果證實了針刀松解法對肩周炎模型兔的治療作用，同時實驗結果也表明早期干預對肩周炎模型兔病理有確切的改善作用，為臨床針刀治療肩周炎應盡早介入提供了實驗依據。

[1]Bunker T Danthony P P.The pathology of frozen shoulder.A Dupuytren-like disease[J].The Journal of Bone and Joint Surgery,1995,77(5):677-683.

[2]徐洪璋,余斌.小針刀療法治療肩周炎研究進展[J].第一軍醫大學分校學報,2002,25(2):148-151.

[4]熊昌源,畢學薇,劉松林,等.持續機械勞損加冰敷復制實驗性兔肩關節周圍炎的病理學觀察[J].中醫藥研究,1995(5):52-53.

[5]LI H-,yao G-h,xia C-s.Effects of transforming growth factor beta-1 on proliferation and collagen production of tendon sheath fibroblasts,epitenon tenocytes and endotenon tenocytes[J].Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research,2007,11(41):8404-8407.

[6]Ngo M,phan H,longaker M T,et al.Differential expression of transforming growth factor-beta receptors in a rabbit zone II flexor tendon wound healing model[J].Plastic and Reconstructive Surgery,2001,108(5):1260-1267.

[7]Rodeo SA Hannafin J,atom J,et al.Immunolocalization of cytokines and their receptors in adhesive capsulitis of the shoulder[J].Journal of Orthopaedic Research:Official Publication of the Orthopaedic Research Society,1997,15(3):427-436.

[8]李宏云,陳世益,翟偉韜,等.凍結肩患者關節囊組織中TGF-β和MMPs表達研究[J].上海交通大學學報(醫學版),2009,29(11):1363-1366.