HPLC法測定腰腿痛寧中柚皮苷的含量

聞 輝，李曉春，王 沛,李雪婷,趙文海

(長春中醫藥大學，吉林 長春 130117)

腰腿痛寧是長春中醫藥大學附屬醫院應用多年的協定處方，由骨碎補、鹿角霜、熟地黃、北黃芪、狗脊、當歸等10幾味名貴中藥組成，具有補腎強筋壯骨之功效，臨床療效確切。為將其由醫院制劑室的協定處方開發成為新藥面世，特制定如下控制該制劑質量的標準及方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀Waters 600，美國沃特世公司；超聲波清洗儀KQ-DB-3200，昆山市儀器廠；旋轉蒸發儀R-202，上海申花生物科技公司；SHB-3型循環多用真空泵，鄭州市杜甫儀器有限公司；AL-204型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 藥品與試劑 柚皮苷對照品，中國藥品生物制品檢定所，批號：110722-200611；腰腿痛寧制劑，由長春中醫藥大學附屬醫院制劑室提供(批號分別為110301、110303、110401、110402、110403、110404)；陰性對照品，由本研究室自制；甲醇、色譜純(西隴化工股份有限公司)，水(杭州娃哈哈純凈水)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜分析 色譜柱：Autanlit C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：甲醇-磷酸溶液(0.10 mol/L)20∶80；流速：1.0 mL/min ；檢測波長：283 nm；柱溫：22 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 樣品溶液的制備 取腰腿痛寧制劑約2 g，精密稱定，加甲醇50 mL，加熱回流4 h,放冷，濾過，濾液置于50 mL容量瓶中，用少量甲醇分次洗滌容器，洗液濾入同一量瓶中,加甲醇定容至刻度[1]，搖勻，用0.45 μm 微膜濾過，取濾液，作為制劑樣品供試品[2]。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取經80 ℃干燥至恒重的柚皮苷對照品4.300 mg，置于100 mL容量瓶中，用色譜純甲醇溶解，并加至刻線，搖勻,即得(每1 mL中含柚皮苷對照品0.043 0 mg)。

2.4 陰性對照品溶液制備 按處方比例稱取除骨碎補外的其他藥物，按腰腿痛寧制劑制法制成的陰性對照品制劑，再按2.2項下方法制備陰性對照品。

2.5 系統適應性試驗 分別取標準品溶液、樣品溶液、陰性對照品溶液按2.1項下色譜條件下進行分析,理論塔板數不低于4 000，陰性對照對供試品測定無干擾，色譜圖見圖1。

2.6 標準曲線的制備 精密吸取2.3項下柚皮苷對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，分別精密吸取20 μL進樣。 以柚皮苷對照品進樣量為橫坐標，柚皮苷峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程為：Y=1 627 809.246 5X+161 87.282 5，r=0.999 8(n=6)。

結果表明，柚皮苷在0.086 0～0.532 1 μg之間與峰面積呈良好線性關系。

2.7 精密度實驗 精密吸取2.3項下的柚皮苷對照品溶液6分，每分4.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，分別精密吸取20 μL進樣，測定色譜峰面積。計算得柚皮苷對照品的平均峰面積為577 287.912，RSD值為0.064 9%，結果表明該實驗有良好的精密度。

2.8 穩定性實驗 取供試樣品適量,精密稱定，依照樣品溶液制備方法制備制劑樣品溶液，室溫(25 ℃)下放置0、2、4、8、16 h時，分別測定各樣品的峰面積，結果所取供試樣品平均峰面積為677 217.293，RSD值為1.98%。峰面積無明顯變化，說明此時間內，供試樣品溶液化學性質穩定。

2.9 樣品測定 分別取腰腿痛寧成品6批(110301、110303、110401、110402、110403、110404)適量，按2.2項下操作制備供試品溶液，再按上述色譜條件進行分析，根據外標法測定面積并計算柚皮苷含量，見表1。結果符合所擬定的含量波動范圍(95%～105%)。

a.標準品液相圖譜

b.樣品液相圖譜

c.陰性對照液相圖譜

表1 腰腿痛寧中的柚皮苷含量(n=5)

2.10 回收率試驗 采用加樣回收法，分別取已知含量的樣品5分，精密稱定，按2.2項下操作制備樣品溶液，置于50 mL容量瓶中，再分別精密加入2.3項下的對照品溶液4 mL，甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微膜濾過，取濾液，分別吸取20 μL進樣測定色譜峰峰面積。結果加樣平均回收率為100.02%，RSD值為0.158 3%。

3 討論

3.1 控制指標的選擇 骨碎補為方中主藥，是骨傷科常用中藥，具有補腎強骨、續傷止痛功效。骨碎補主要含有二氫黃酮、黃烷-3-醇及其衍生物、二聚物和三聚物類、三萜、酚酸、原兒茶酸等多種化學成分，其中二氫黃酮(以柚皮苷為代表)是其主要活性成分，有促進骨折愈合、防治骨質疏松、抗氧化、調血脂、抗炎、鎮痛等生物活性[2-4]。所以選擇控制骨碎補中的柚皮苷含量為該中藥復方的質量指標。

3.2 色譜條件的選擇 本實驗測定方法采用的色譜條件是根據上述樣品的溶解性，并參考相應的文獻[5-9],經逐步實驗考察，同時考慮到今后的規模化生產狀況成本而定。

[1]王志懦,王文彬,喬亭祥,等.用放射性同位素45鈣對中草藥骨碎補治療骨傷作用原理的探討[J].北京中醫學院學報,2002,3(3):13.

[2]才謙,劉玉強.HPLC法測定舒筋定痛片中柚皮苷的含量[J].中成藥,2008,30(4):附3-4.

[3]Chang E J,Lee W J,Cho S H,et al.Proliferative effects of flavan-3-ols and propelargonidins from rhizomes of Drynariafortunei on MCF-7 and osteoblastic cells [J].Arch PharmRes,2003,26(8):620-630.

[4]周銅水,周榮漢.槲蕨根莖的脂溶性成分研究[J].中草藥,1994,25(4):175-178.

[5]馬克昌,高子范,馮坤,等.骨碎補提取液對小雞骨發育的促進作用[J].中醫正骨,2007,2(4):7.

[6]馬克昌,高子范,張靈菊,等.骨碎補對大白鼠骨質疏松模型的影響[J].中醫正骨,2007,4(4):3.

[7]周銅水,周漢榮.骨碎補對大鼠實驗性骨損傷愈合的影響[J].中藥材,2006,25(5):249.

[8]劉斌,司徒鎮強,吳軍正,等.枸杞和骨碎補對 HGF體外附著與生長的影響[J].中華口腔醫學雜志,2002,27(3):159.

[9]樊粵光.骨碎補提取液對體外分離破骨細胞性骨吸收的作用[J].中國中醫骨傷科雜志,2003,11(6):4.