木黃酮靶向抑制MKN－45胃癌細胞Notch1蛋白表達及對增殖和凋亡的影響

陜西省鎮安縣醫院（鎮安711500） 柯 俊 胡應秀 王 康

Notch信號通路是重要的發育分化通路之一［1］，參與細胞分化、增殖和凋亡過程。最新研究顯示Notch信號通路也參與肺癌、胰腺癌、基底細胞癌等腫瘤演進過程［2］。胃癌細胞和組織中都高表達Notch1蛋白［3］，提示Notch1蛋白可能在胃癌發生發展中扮演重要角色。本研究使用Notch1蛋白特異性抑制劑木黃酮干預胃癌細胞MKN－45，探討Notch1在胃癌細胞增殖和凋亡中的作用。

材料與方法

1 材 料 人胃癌細胞株MKN－45細胞購自中科院上海生命研究所。DMEM培養基，胎牛血清（FBS）購自杭州四季青公司。四甲基偶氮唑鹽（MTT），二甲基亞砜（DMSO）均購自美國Sigma公司。兔抗人Notch 1多克隆抗體，鼠抗人β－actin單克隆抗體，HRP標記山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG二抗均購自Santa Cruz公司。Annexin V－FITC/PI熒光雙標試劑盒購自深圳生物元公司。PCR Mix購自西安潤德公司，PCR引物合成于上海生工公司。木黃酮（Genistein）購自Calbiochem公司，并以DMSO溶解配制成100mmol/L濃度保存于－20℃備用。對照組細胞使用相應濃度DMSO處理。

2 細胞培養與干預 人原發性胃癌細胞株MKN－45于含10%胎牛血清的DMEM 培養液中，37℃，5%CO2培養，2～3d用0.25%胰酶消化傳代。取對數生長期的細胞進行試驗。分組：等濃度DMSO溶劑對照（正常對照）組、10μmol/L木黃酮（10μM 木黃酮）組、30μmol/L 木 黃 酮 （30μM 木 黃 酮）組 和50μmol/L木黃酮（50μM 木黃酮）組。

3 MTT法細胞增殖實驗 取對數生長期的MKN－45細胞，制成懸液，以每孔5×104個細胞接種于96孔培養板，每孔培養液為200μl。每組設4個復孔，37℃、5%CO2細胞培養箱中培養。12h后換加無血清DMEM培養液200μl繼續培養12h，使細胞周期同步化，然后換加含10%血清培養液，分別再培養12h、24h、36h、48h、60h、72h后終止培養，在避光條件下加5mg/ml MTT溶液20μl/孔，孵育4h，棄上清液，避光條件下加DMSO 150μl/孔，置酶標儀上振蕩10min。以空白孔調零，測各孔490nm吸光度（OD）值。試驗重復3次。

4 流式細胞術檢測細胞凋亡 分組干預細胞，到達預訂時間點后，PBS沖洗1次，常規消化，1500rpm離心5min，棄去上清，用PBS再洗滌1次，1500rpm離心5min后棄去上清，加入500μl的1×Binding Buffer后加入5μl Annexin V－FITC，再加入10μl PI，輕輕混勻。室溫下，避光反應5～15min。1h后進行流式細胞術測定。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為（FITC－/PI－）；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為（FITC＋/PI＋）；而右下象限為凋亡細胞，顯現（FITC＋/PI－）。

5 Westen blot檢測蛋白表達 選擇生長良好的細胞1×107個，蛋白裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度。SDS－PAGE凝膠電泳，轉膜至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1h。加一抗稀釋液4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜后加入二抗稀釋液室溫孵育1h。ECL化學發光，暗室顯影。

6 PCR檢測mRNA轉錄 用Trizol法提取各組細胞總RNA。取5μg按反轉錄試劑盒說明反轉錄為cDNA。以cDNA為模板PCR擴增Bcl－2，Bax，以GAPDH為內參照。各目的基因引物序列如下：Bcl－2：5’－GGA TTG TGG CCT TCT TTG AG－3’，5’－CCA AAC TGA GCA GAG TCT TC－3’（擴增片段 234 bp）；Bax：5’－TCC ACC AAG AAG CTG AGC GAG－3’，5’－GTC CAG CCC ATG ATG GTT CT－3’（擴增片段 257bp）；GAPDH：5’－GTA AAG ACC TCT ATG CCA TCA－3’，5’－GGA CTC ATC GTA CTC CTG CT3－3’（擴增片段452bp）。PCR反應條件：94℃30s，60℃30s，72℃30s共35個循環。PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統觀察電泳結果并拍照。用Quantity One軟件對照片進行灰度值掃描，以目的條帶與其相應內參GAPDH的光密度比代表目的基因mRNA的相對水平。每一時間點上述實驗重復3次以上。

7 統計學處理 以均數±標準差表示，應用SPSS15.0軟件處理數據，應用單因素方差分析，其中多組資料兩兩比較采用LSD多重檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

結 果

1 木黃酮干預對MKN－45細胞增殖的抑制作用見圖1。MTT結果顯示，木黃酮干預明顯抑制MKN－45細胞的增殖。在12、24、36、48、60、72h，正常對照組的OD值分別為0.366±0.026、0.482±0.011、0.648±0.029、0.859±0.043、1.117±0.017、1.483±0.057，10μM 木黃酮組的 OD 值分別為0.364±0.013、0.458±0.052、0.634±0.046、0.798±0.028、0.978±0.034、1.359±0.058，30μM 木黃酮組的 OD值分別為0.364±0.022、0.381±0.005、0.460±0.037、0.576±0.029、0.81±0.087、0.827±0.036，50μM 木黃酮組的OD值分別為0.330±0.016、0.318±0.014、0.434±0.031、0.479±0.027、0.71±0.087、0.727±0.092。自36h開始，30μM木黃酮組和50μM木黃酮MKN－45細胞增殖率與正常對照組（P＜0.05）或10μM木黃酮組（P＜0.05）相比，差異均有顯著性意義。

圖1 木黃酮干預對MKN－45細胞增殖的抑制作用

2 木黃酮干預對MKN－45細胞Notch1蛋白表達的抑制作用 見圖2。木黃酮干預MKN－45細胞48h，經 Western blot法檢測發現（圖2A）：與正常對照組（1.06±0.06）相比，30μM 木黃酮組（0.50±0.02）和50μM 木黃酮組（0.24±0.04）細胞 Notch 1蛋白的表達水平均明顯降低（P＜0.05）；而10μM木黃酮組（0.95±0.06）和正常對照組之間 Notch1蛋白的表達水平無明顯差異。

圖2 木黃酮干預對MKN－45細胞Notch1蛋白表達的抑制作用

3 木黃酮干預對MKN－45細胞凋亡的促進作用見圖3。不同濃度木黃酮干預細胞48h，通過Annexin V－FITC/PI熒光雙標流式細胞術檢測各組細胞的凋亡狀況。結果（圖3A）發現，正常對照組、10μM木黃酮組、30μM木黃酮組和50μM木黃酮組凋亡細胞數分別為3.13±0.78，3.82±0.99，7.96±10.90和13.49±0.82，4組間差異具有統計學意義（P＜0.05）。與正常對照組或10μM木黃酮相比，30μM木黃酮和50μM木黃酮組 MKN－45細胞凋亡細胞數明顯上調（P＜0.05）（圖3B）。

圖3 木黃酮干預對MKN－45細胞凋亡的促進作用

4 木黃酮干預對 MKN－45細胞Bcl－2和Bax mRNA表達的抑制作用 見圖4。木黃酮干預MKN－45細胞48h，通過RT－PCR法檢測各組細胞的Bcl－2和Bax mRNA表達水平（圖4A）。結果顯示：30μM木黃酮和50μM木黃酮組 MKN－45的Bcl－2mRNA的相對表達強度與正常對照組（P＜0.05）或10μM木黃酮組（P＜0.05）相比明顯下調，差異具有顯著性意義；同時，Bax－2mRNA的相對表達強度與正常對照組（P＜0.05）或10μM 木黃酮組（P＜0.05）相比明顯上升，差異具有顯著性意義（圖4B）。

圖4 木黃酮干預對MKN－45細胞Bcl－2和Bax mRNA表達的抑制作用

討 論

Notch信號通路是調控細胞分化、發育的關鍵性通路。Notch蛋白是一個進化高度保守的跨膜受體蛋白家族。在人體細胞中共發現了Notch1、Notch2、Notch3和Notch4共4個Notch同源體。1991年Ellisen LW在人類T淋巴母細胞白血病中鑒定出Notch1，首次提示了Notch信號通路與腫瘤有關［4］。近年來日漸增多的證據表明Notch1與腫瘤發生密切關聯，各種腫瘤中起致癌作用［1］。胰腺癌細胞中Notch1的下調表達明顯抑制了癌細胞的生長和促進凋亡［5］。Notch1在不同腫瘤乃至同一腫瘤中不同的、甚至相反的作用，提示闡明Notch信號通路調控機制尚需大量的探索研究。木黃酮是來源于豆類植物的一種小分子黃酮類物質。該物質具有一系列廣泛多樣的生物活性，對腫瘤、心血管疾病、骨質疏松、糖尿病、皮膚病等疾病的發生有一定的預防和治療作用，其中最重要的作用是抑制腫瘤發生發展［6］。雖然研究表明異黃酮抗腫瘤的分子機制可能抑制原發腫瘤增殖和凋亡相關蛋白有關［7］，但是具體機制尚未完全明了。最新研究顯示了木黃酮具有特異性的Notch1蛋白抑制活性，其抑制效果與Notch1蛋白RNA干擾相當［8］，顯示了具有相當前景的腫瘤治療潛力。本研究發現通過不同濃度的木黃酮干預人源性胃癌MKN－45細胞，結果提示：與正常對照組相比，30μM 和50μM 異黃酮顯著抑制胃癌細胞增殖，其效果和干預時間有關。這與文獻報道木黃酮抑制腫瘤細胞的增殖能力的結果相符［9］。研究中，我們選擇了木黃酮對 MKN－45細胞增殖發生明顯影響的干預48h這個時間點做進一步試驗。Western blot結果顯示木黃酮能下調Notch 1蛋白表達，其程度和趨勢與抑制細胞增殖基本相符，提示其抗增殖作用與抑制Notch 1蛋白表達相關。通過流式細胞術分析，我們發現木黃酮能顯著誘導胃癌MKN－45細胞凋亡，其效果與木黃酮濃度和Notch 1蛋白抑制程度存在正向關聯。因而我們推測木黃酮通過抑制Notch1后誘導細胞凋亡的可能機制是與Notch1相關的凋亡信號通路活性受到上調。

因此本研究使用RT－PCR檢測不同濃度木黃酮干預胃癌MKN－45細胞48h后凋亡相關分子Bcl－2和Bax mRNA的表達。Bcl－2基因是一種原癌基因，它具有抑制凋亡的作用。在細胞凋亡過程中，Bcl－2家族成員起著至關重要的作用［10］。Bcl－2家族可以分為兩大類，一類是抗凋亡的，主要有Bcl－2、Bcl－XL、Bcl－W 等，另一類是促細胞死亡的，主要包括Bax、Bak、Bad、Bik、Bid等。Bcl－2是細胞凋亡的負性因子，能保護細胞免于凋亡。Bax是極重要的促細胞凋亡基因，有對抗Bcl－2抑制細胞凋亡的作用。Bcl－2/Bax之間的比例，是決定對細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵因素，Bcl－2＞Bax時細胞趨于存活；Bax＞Bcl－2時細胞趨于凋亡。我們發現，木黃酮干預胃癌細胞48h時，伴隨著Notch1表達受抑和凋亡細胞數上升，其Bcl－2mRNA下調，Bax mRNA上調。結果說明經木黃酮干預胃癌細胞MKN－45抑制Notch l蛋白表達后，通過調節凋亡相關分子Bcl－2和Bax誘導了細胞凋亡。

總之，我們應用木黃酮特異性抑制胃癌細胞MKN－45的Notch l表達，通過抑制Notch通路活性而抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡，由此研究Notch通路在胃癌分子病理機制中的重要作用，并展示了木黃酮作為Notch 1特異性抑制劑在治療胃癌方面的廣泛前景，為胃癌治療新手段提供理論依據。

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