RP-HPLC測定撥云錠中龍膽苦苷的含量

袁文娟 高文分

摘 要：目的：建立撥云錠中龍膽苦苷含量測定方法。方法：采用Agilent ZORBAX SB C18柱（250 mm×46 mm,5 μm）為色譜柱，流動相：甲醇-水（30∶70），流速10 ml?min-1，檢測波長：270 nm。結果：龍膽苦苷的線性范圍為01624 μg ~16240 μg，r＝09999，平均加樣回收率（n＝6）為9879%，RSD為057% 。結論：該方法簡便快速、結果準確可靠，適用于撥云錠的質量控制 。

關鍵詞：撥云錠；龍膽苦苷； RP-HPLC

中圖分類號：R2841

文獻標識碼：A

文章編號：1007-2349（2012）06-0061-02

撥云錠是衛生部頒布的國家基本藥物，由爐甘石（煅）、龍膽浸膏、冰片、麝香等10味中藥組成，具有明目退翳，解毒散結，消腫止痛之功效。用于暴發火眼，目赤腫痛，痧眼刺痛，目癢流淚，翼狀胬肉，白內障，牙齦腫痛，喉舌紅腫［1］。適用于沙眼，瞼緣炎，麥粒腫，急性結膜炎，慢性結膜炎，過敏性角膜炎，化膿性角膜炎，角膜云翳。有研究表明：撥云錠具有廣譜抗菌作用，其中對金黃色葡萄球菌，白葡菌，甲、乙型鏈球菌的抗菌活力最強，低濃度呈較強的抑菌作用，高濃度呈現殺菌作用［2］。該藥對動物的在體試驗—家兔試驗性角膜潰瘍也呈現相同的作用［3］。撥云錠質量標準中缺少含量測定項，藥品內在質量難以評定，本文建立了HPLC方法測定藥品中龍膽苦苷的含量，為撥云錠的質量控制提供了科學依據。

1 儀器與試劑

Agilent1100高效液相色譜儀,帶四元泵；VWD可變波長紫外檢測器；自動進樣器；在線真空脫氣機；智能化柱溫箱及HP化學工作站；甲醇為HPLC級，水為超純水。龍膽苦苷對照品（中國藥品生物制品檢定所 含量測定用，批號：110770-200712）。六批撥云錠樣品均由云南老撥云堂藥業有限公司提供。

2 方法與結果

21 溶液的制備 對照品溶液：精密稱取龍膽苦苷對照品適量，加甲醇制成 0050 mg?mL-1的對照品溶液。

供試品溶液：取重量差異項下的本品，研細，混勻，取約028 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理（功率250 W，頻率33 KHz）15 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，取上清液，用微孔濾膜（045 μm）濾過，濾液作為供試品溶液。

陰性樣品溶液：按處方比例制成不含龍膽浸膏的撥云錠陰性樣品，按供試品溶液制備方法，制成陰性樣品溶液。

22 色譜條件及系統適應性試驗 色譜柱：Agilent ZORBAX SB C18柱 (46×250 mm 5 μm)； 流動相：甲醇-水（30∶70）；流速：10 mL?min-1；柱溫：30℃；檢測波長：270 nm；進樣量：10 μL；外標法。在此色譜條件下，龍膽苦苷與其它成分均能達到基線分離，撥云錠中的其它成分對龍膽苦苷的含量測定無干擾。結果見圖1。

a 對照品；b 樣品；c 陰性樣品；1 龍膽苦苷

圖1 撥云錠HPLC色譜圖

23 線性關系考察 精密稱取龍膽苦苷對照品適量，置量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再以甲醇稀釋至一系列濃度的對照品溶液，按上述色譜條件分別進樣10 μl，記錄色譜圖，以峰面積（Y）對進樣量（X）作回歸統計，得回歸方程為Y=110793X+688，r= 09999（n=10），線性范圍為01624 μg~16240 μg。

24 穩定性試驗 精密吸取取供試品溶液分別在0，2，4，8，14 h進樣，測得龍膽苦苷的峰面積， RSD為029％；表明樣品溶液在14 h內基本穩定。

25 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μl，連續進樣6次，測得龍膽苦苷的峰面積，其峰面積的RSD分別為038％。表明儀器的精密度良好。

26 重復性試驗 精密稱取同一批號撥云錠樣品，平行制備6份供試品溶液，按“21”項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別測定龍膽苦苷的含量， RSD為050％，表明方法的重現性較好。

27 加樣回收率試驗 取已知含量的撥云錠樣品約014 g，精密稱定，共6份，加入一定量的龍膽苦苷對照品溶液，揮干溶液，按“21”項下供試品溶液制備成加樣回收率供試液，并依法測定，結果見表1。

表1 龍膽苦苷加樣回收率試驗結果（n＝6）

樣品理論量

/mg 加入量

/mg 實測量

/mg 回收率

/％ 平均回收率

/％ RSD

/％

09976 1068 2055 98979

09897 1068 2046 98934

09828 1068 2033 98363 9879 057

09843 1068 2030 97876

09824 1068 2043 99292

09815 1068 2042 99314

28 含量測定 取不同批次的撥云錠樣品，按供試品溶液的配制項下制備供試品溶液，每個批次的樣品平行制備3份，分別測定龍膽苦苷的含量，結果見表2。

表2 撥云錠中龍膽苦苷的含量測定結果（n＝3）

批號 龍膽苦苷(mg/錠) RSD/%

20060601 1156 058

20061001 1033 064

20061002 1600 071

20061003 1694 039

20060602 1220 054

20060201 1284 026

29 檢測限 取配制好的對照品溶液，用甲醇逐級稀釋成一系列濃度，依次測定，至主峰與基線噪音峰高比約為3∶1，記錄此時的色譜圖及濃度，結果龍膽苦苷的檢測限為538 ng。

3 討論

31 檢測波長的選擇 試驗采用紫外可見分光光度計對龍膽苦苷的甲醇溶液進行掃描，結果于270 nm與253 nm波長處有最大吸收。由于253 nm波長處的吸收度低于270 nm波長處的吸收，從檢測靈敏度的角度考慮，選擇270 nm作為本次試驗的檢測波長。

32 提取溶劑的選擇 龍膽苦苷為裂環環烯醚萜苷類成分［4］，易溶于甲醇、水，可溶于乙醇?？疾炝瞬煌瑵舛鹊募状?、乙醇和水為溶劑的提取結果，結果表明純甲醇的龍膽苦苷提取率最高。故選擇純甲醇作為提取溶劑。

33 提取方法的考察 龍膽苦苷為熱不穩定性成分，研究表明超聲法和冷浸法所制備的供試品溶液中龍膽苦苷的含量明顯高于索氏提取法和熱回流法［5］。本次試驗分別考察了以甲醇為溶劑的兩種提取方法，分別為冷浸法，超聲法。這兩種提取方法中龍膽苦苷的含量無顯著性差別?？紤]到超聲法與冷浸法相比，超聲法更簡單，易行，快捷，故采用超聲法，以甲醇為提取溶劑。此外，本次試驗對超聲時間進行了考察，依次測定了超聲提取5 min、10 min、15 min、30 min以及60 min龍膽苦苷含量測定的結果。結果表明采用純甲醇為溶劑，超聲提取15 min時，龍膽苦苷成分提取完全。

34 流動相的選擇 本次試驗參照文獻考察了以甲醇－水為流動相的系統［6］與以乙腈－水為流動相的系統［7］，結果表明，以甲醇－水（30∶70）為流動相，可是龍膽苦苷的分離度，理論塔板數、峰的對稱性及出峰時間達到滿意的結果。

本次試驗建立的高效液相色譜法測定撥云錠中龍膽苦苷的含量，該法靈敏、快速、準確，可用于撥云錠的質量控制。

參考文獻：

［1］衛生部藥品標準第二十冊盬S3—B—3875—98［S］. 1998：170

［2］王迪，鄭英，陳金秀 撥云錠眼藥對9種常見致病菌的體外抗菌作用觀察［J］.眼科研究，2002，20（4）：365~366

［3］宋鵬 撥云錠對家兔實驗性角膜潰瘍的治療效應［J］.現代應用藥學，1989，（2）：1~2

［4］徐國鈞，徐珞珊 中國藥材學［M］. 北京：中國醫藥科技出版社，1996：365

［5］韓雙，李瑋，席先蓉 貴州不同地區堅龍膽中龍膽苦苷的含量測定［J］. 醫藥導報，2006，28（6）：783~785

［6］吳立宏，葉燕，李興尚，等 反相高效液相色譜法測定道地產區秦艽藥材中龍膽苦苷的含量［J］. 藥物分析雜志，2009，29（2）：184~187

［7］李萍 高效液相色譜法測定風濕靈膠囊中龍膽苦苷含量［J］. 中國藥業，2009，18（13）：25~26

(收稿日期：2012-04-28）