心肌營養素—1在急性肝衰竭大鼠中的動態變化

潘珍珍　陳永平　潘陳為

[摘要] 目的 觀察心肌營養素-1（CT-1）在急性肝衰竭大鼠中的動態變化及意義探討。 方法 大鼠腹腔注射D-氨基半乳糖（D-Gal）建立急性肝衰竭模型，在造模后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、120 h、168 h分別留取肝組織，用RT-PCR法檢測肝臟CT-1mRNA的表達，并用免疫組織化學方法檢測環氧化酶-2（COX-2）蛋白的表達。 結果 CT-1在正常大鼠中表達很少，造模后12 h開始表達增多（P < 0.05），于48 h時達高峰值，隨后逐漸下降； COX-2在正常組未見蛋白表達，造模后6 h表達量逐漸增多，至48～72 h時達高峰。 結論 CT-1參與了D-Gal誘導的肝衰竭模型的發生發展，有可能為急性肝衰竭的治療提供一個新的治療靶點。

[關鍵詞] 心肌營養素-1；急性肝衰竭；環氧化酶-2

[中圖分類號] R575[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-9701（2012）32-0001-03

心肌營養素-1（cardiotrophin-1，CT-1）是Pennica D等[1]于1995年發現的IL-6家族新成員，它具有廣泛的生物活性。最近的研究發現，CT-1 在多種肝損傷的動物模型中發揮著較好的保護作用，促進肝細胞再生作用。急性肝衰竭（acute liver failure， ALF）是由于肝細胞大量壞死而導致肝功能嚴重受損為特征的綜合征，因此如何減少肝細胞的凋亡和壞死、促進殘存肝細胞再生，是改善急性肝衰竭患者預后的重要因素。本實驗通過建立急性肝衰竭大鼠模型，采用半定量逆轉錄聚合酶反應法（RT-PCR）檢測肝組織中CT-1的表達，并結合肝功能、COX-2的相應變化以探討CT-1在急性肝衰竭中的作用。

1 材料和方法

1.1 藥品及試劑

RT-PCR試劑盒（晶美生物公司），引物由上海基康公司合成，二步法免疫組化檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司產品，PV-6001），COX-2單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司，ZA-0515），D-Gal（重慶醫科大學生物工程研究室，批號20041018）。

1.2 動物模型及分組

雄性SD大鼠，48只，體重200 g左右（溫州醫學院動物中心提供），用隨機數字表將大鼠分成2組。A組（肝衰竭模型組42只）：將10%的D-氨基半乳糖按1.4 g/kg劑量腹腔注射，建立肝衰竭模型。分別于造模后的6、12、24、48、72、120、168 h 7個時間點各處死6只大鼠，取血及肝組織。B組（正常對照組6只）：按1.4 g/kg劑量生理鹽水腹腔內注射，記為0 h，取血及肝組織。

1.3 肝功能檢測

采用全自動生化分析儀檢測ALT、AST水平。

1.4 COX-2蛋白表達的檢測及HE染色

用10%中性甲醛固定的肝組織，石蠟包埋，4 μm病理切片，按說明書進行免疫組化染色及HE染色，COX-2免疫組化結果使用美國IPP5.0（Image Pro-plus 5.0）專業圖像分析軟件測定平均光密度值，用陽性部位的光密度值減去背景的光密度值，即為陽性部位的吸光度值。

1.5 CT-1mRNA表達的檢測

按Trizol試劑盒說明提取RNA，用半定量RT-PCR測定肝組織CT-1mRNA的表達。三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內參。GAPDH引物：上游 5'-ACCACAGTCCATGCCAT-3'，下游：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，產物452bp。CT-1引物：上游5'-GCCAAGATCCGACAGACAC -3'，下游：5'- GC ACAGCATCCAATAGCG-3'，產物241bp。PCR擴增參數：95℃5 min；94℃ 30 s；56℃ 45 s；72℃ 40 s；35個循環；72℃ 7 min。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，并用100bp Ladder Marker 作分子量標準，在凝膠成像系統顯像，用Gel-Pro 3.1軟件半定量分析不同時相CT-1/GAPDH灰度比值。

1.6 統計學分析

采用SPSS11.5軟件進行統計處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。方差齊性者兩兩比較采用LSD-T法，方差不齊者進行Dunnets T3法。P < 0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝功能ALT、AST水平變化

肝衰竭模型組大鼠ALT、AST造模后6 h就開始上升（P < 0.05），于48～72 h達高峰值，此后逐漸下降。見表1。

2.2 HE染色結果

正常對照組肝組織肝小葉結構完整，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列。肝衰竭模型組在造模后24～48 h發現肝細胞廣泛壞死，肝索解離，肝小葉結構破壞，殘存肝細胞發生不同程度的水腫變性，中央靜脈匯管區及壞死區有巨噬細胞和淋巴細胞為主的炎細胞浸潤。見圖1、圖2。

2.3 COX-2蛋白的檢測結果

正常對照組未見COX-2蛋白表達，肝衰竭模型組在造模后6 h表達量逐漸增多（P < 0.05），至48～72 h時達高峰，較24 h有明顯增多，以中央靜脈匯管區及壞死區周圍表達最為明顯。見表2、圖3、圖4。

2.4 CT-lmRNA的檢測結果

正常大鼠肝細胞中CT-1mRNA表達很少，肝衰竭模型組在造模后12 h開始明顯增多，與正常對照組相比，差異有統計學意義（P < 0.05），于48 h時達高峰值，隨后逐漸下降。見表2，圖5。

3 討論

急性肝衰竭（ALF）是肝細胞廣泛變性、壞死引起肝功能嚴重損害的臨床綜合征，病死率極高，因此成功建立急性肝衰竭動物模型是研究ALF的基本條件。在本實驗中，通過腹腔注射1.4 g/kgD-氨基半乳糖誘導急性肝衰竭大鼠，結合肝功能ALT、AST變化及HE染色結果，說明ALF模型的成功建立。

目前的研究發現，CT-1在多種肝損傷的動物模型中發揮著較好的保護作用，但國內外尚無關于CT-1在D-氨基半乳糖誘導的ALF動物肝組織中的動態表達。本實驗中，通過動態觀察大鼠肝組織中CT-1mRNA的變化，結果發現肝衰竭模型組CT-1的變化趨勢與AST、ALT相同，表明了CT-1參與了D-氨基半乳糖誘導的肝衰竭模型的發生發展。本實驗結果顯示CT-1mRNA在正常組表達很少，肝衰竭模型組在造模后12 h開始增多，于48 h時達高峰值，在168h仍高于正常對照組。這與Bustos M等[2]研究的肝再生模型中的表現稍有區別，后者是通過肝大部分切除構建肝衰竭，CT-1表現為造模后24 h達到高峰，于144 h回到基礎水平，這可能同兩種建模方法所致的肝衰竭機制不同有關。Inguez M等[3]研究發現在肝臟缺血再灌注損傷中，缺血損傷可見CT-1表達，隨肝細胞損傷程度加重而表達增多，并且非缺血部位其表達更加明顯。同時實驗前預先靜脈注射CT-1，可以抑制缺血再灌注造成的肝損傷，這提示內源性與外源性CT-1均具有明顯的肝臟保護作用。CT-1基因敲除小鼠肝臟更容易遭受Fas因素誘導的凋亡打擊。外源性CT-1對刀豆蛋白A誘導的大鼠和小鼠肝炎模型有良好的保護作用[4]。但目前CT-1保護肝細胞的機制尚不十分清楚。

環氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）是催化花生四烯酸轉化為重要活性物質前列腺素初始步驟的關鍵限速酶。最近的一些研究顯示COX-2在炎癥的開始和治療階段均有作用。Tsukada 等發現COX-2在肝表達，并且在肝損傷時上調，同時使用選擇性COX-2抑制劑，可使肝損傷加重[5]。國外有報道在臨床使用非類固醇類抗炎藥抑制COX-2活性和前列腺素的產生從而導致了肝損傷。本實驗免疫組化結果表明正常對照組未見COX-2蛋白表達，造模后6 h表達量逐漸增多，至48～72 h時達高峰，以中央靜脈匯管區及壞死區周圍表達最為明顯。并且結果發現COX-2與CT-1的變化趨勢相一致，并略早于CT-1的升高，這提示了可能與COX-2刺激CT-1表達有關。Beraza等[6]研究也證明了COX-2與肝細胞再生之間以及與CT-1之間的聯系，并指出肝部分切除不久后COX-2的激活和前列腺素的產生是對于肝增殖及CT-1的正確誘導是必須的。

本實驗研究表明CT-1參與了急性肝衰竭大鼠的發生發展，可能參與肝臟再生作用，有可能為急性肝衰竭的治療提供一個新的治療靶點，但有關其具體機制，尚需進一步探討。

[參考文獻]

[1]Pennica D，King KL，Shaw KJ，et al. Expression cloning of cardiotropin-1，a cytokine that induces cardiac myocyte hypertrophy[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1995，92（4）：1142-1146.

[2]Bustos M，Beraza N，Lasarte JJ， et al. Protection against liver damage by cardiotrophin-1：a hepatocyte survival factor up-regulated in the regenerating liver in rats[J]. Gastroenterology，2003，125（1）：192-201.

[3]Inguez M，Martinez-Anso E，Beraza N，et al. Cardiotrophin-1 efficiently protects the liver against ischemia-reperfusion （I/R）injury[J]. Journal of Hepatology，2004，40（1）：48.

[4]Marques JM，Belza I，Holtmann B，et al. CardiotroPhin-1 is an Essential faetor in the natural defense of the liver against apoptosis[J]. Hepatology， 2007，45（3）：639-648.

[5]Tsukada K，Hasegawa T，Tsutsumi S，et al. Roles of cyclooxygenase-2 in tissue injury during hemorrhagic shock[J]. Shock，2000，13（5）：392-397.

[6]Beraza，Margués JM，Martínez-Ansó E，et al. Interplay among gardiotrophin-1，prostaglandins，and vascular endothelial growth factor in rat Liver regeneration[J]. Hpatology，2005，41（3）：460-469.

（收稿日期：2012-09-03）