流式細胞術檢測骨肉瘤中RUNX3和β—catenin的表達及意義

吳同申　彭圣智　孟彥

[摘要] 目的 檢測骨肉瘤中RUNX3和β-catenin的表達，探討其關系及臨床意義，以期為臨床工作提供理論支持。 方法 應用流式細胞術檢測86例骨肉瘤（觀察組）及40例良性骨腫瘤（對照組）中RUNX3和β-catenin的表達，觀察其在不同臨床特征中的意義，觀察RUNX3和β-catenin的關系。 結果 RUNX3和β-catenin在骨肉瘤中的表達量明顯低于對照組，骨肉瘤中RUNX3和β-catenin的表達量在不同軟組織浸潤及不同Ennecking分期的比較中，有明顯差別。線性相關分析顯示骨肉瘤中RUNX3和β-catenin具有正相關。 結論 RUNX3和β-catenin在骨肉瘤中表達異常，兩者可能存在協同作用，檢測兩種術后的表達對判斷預后有一定價值。

[關鍵詞] 骨肉瘤；RUNX3；β-catenin；流式細胞術

[中圖分類號] R738.1[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-9701（2012）32-0004-02

骨肉瘤臨床多見，其在發展過程中可見機體多種蛋白質異常表達[1]。RUNX3是一種抑癌基因，定位于染色體1p36.1，基因序列高度保守，對細胞的生長發育過程發揮重要作用[2]。β-catenin是黏附家族的一個經典成員，是上皮細胞表面的重要黏附分子[3]。本實驗應用流式細胞術檢測骨肉瘤中RUNX3和β-catenin的表達，關注其臨床價值，旨在為臨床工作提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

收集我院、山東大學齊魯醫院、山東大學第二醫院經病理證實的骨肉瘤86例新鮮標本作為觀察組。納入均經病理學確診，并符合WHO關于軟組織與骨腫瘤病理學和遺傳學的診斷標準。年齡為18～59歲，平均39.08歲，其中男50例，女36例。患者手術前均未進行任何放化療。對照組為同期在我院治療的良性骨腫瘤術后脫鈣的標本40例，骨樣骨瘤20例，骨母細胞瘤20例，年齡18～56歲，平均38.9歲。兩組在一般臨床特征的比較中，無明顯差別，具有可比性。

1.2 流式細胞術檢測方法

RUNX3和β-catenin試劑均購自武漢博士德生物技術有限公司。RUNX3和β-catenin的檢測應用流式細胞術。具體步驟：將脫鈣后的標本置于不銹鋼網上，將組織剪成碎屑，然后用鑷子輕搓，生理鹽水同時沖洗，直到組織搓完。收集混懸液，過濾，離心，制成1×106/mL單細胞懸液，加入抗體后孵育30 min，然后洗滌，撇棄上清液，加入二抗工作液FITC-IgG 100 μL，孵育30 min，加入PBS 10 mL，離心，撇棄上清。加入PBS，過濾后上機進行檢測[4]。流式細胞儀（美國BC公司生產），免疫熒光數據分析應用系統自帶軟件進行。

1.3 結果判定標準

1.4 統計學處理

采用SPSS 17.0統計學軟件進行分析，計數資料用均數±標準差表示，采用t檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RUNX3和β-catenin在觀察組與對照組中的表達

RUNX3和β-catenin在觀察組與對照組中的表達量均存在明顯差異，P < 0.05。見表1。

2.2 觀察組中不同臨床特征患者RUNX3和β-catenin的表達差異

觀察組中RUNX3和β-catenin的表達與骨肉瘤的軟組織浸潤及Ennecking分期相關。見表2。

2.3 觀察組中RUNX3和β-catenin表達的關系

經線性相關分析，骨肉瘤中RUNX3和β-catenin的表達呈正相關（r = 0.45，P = 0.034 2 < 0.05）。

2.4 觀察組中RUNX3和β-catenin的表達與預后的關系

觀察組患者隨訪時間為8～48個月，平均28.2個月，觀察組中RUNX3和β-catenin的表達與預后相關（P < 0.05），即RUNX3和β-catenin低表達的患者預后差。

3 討論

骨肉瘤是臨床常見，細胞連接和細胞外基質多存在異常。控制RUNX3基因轉錄的是P1和P2啟動子，這兩個啟動子結構不同。P2在外顯子2之前，周圍有一個CpG島，富含GC啟動子的特征，是一個高度保守區。RUNX3與腫瘤的發展有密切關系，是一個抑癌基因，抑癌的機制尚不十分清楚[5]。RUNX3對消化道上皮細胞的生長具有重要的調控作用，能抵抗TGF-β誘導的細胞生長抑制和細胞凋亡，從而調控上皮細胞的分化過程[6]。而當RUNX3 失活時，影響TGF-β凋亡信號的傳導，阻滯正常的凋亡過程，正常細胞的增殖不受限制，出現細胞惡變。β-catenin是黏附家族的成員，與其他黏附家族成員一起與E-cadherin結合，介導腫瘤細胞及上皮細胞的黏附，抑制腫瘤的侵襲和轉移。既往對β-catenin細胞黏附方面的作用研究較多[7]，但是在正常分化成熟的細胞中，β-catenin通過與膜表面的E-cadherin結合參與同質性黏附。當β-catenin降解障礙時，細胞質內β-catenin水平升高，引起β-catenin大量聚集進入細胞核內與轉錄因子結合啟動下游靶基因的轉錄[8，9]。

本實驗通過流式細胞術檢測骨肉瘤中RUNX3和β-catenin的表達特點，結果顯示骨肉瘤中RUNX3和β-catenin的表達量明顯低于對照組，提示RUNX3和β-catenin表達的丟失在腫瘤進展中起重要作用。實驗結果顯示，觀察組中RUNX3和β-catenin的表達量均與有、無軟組織浸潤及Ennecking的分期有關，由于骨肉瘤中軟組織浸潤及Ennecking分期均與患者的預后密切相關，因此術后對骨肉瘤患者行RUNX3和β-catenin的流式細胞術檢測，可能對判斷患者預后有一定價值，即RUNX3和β-catenin低表達患者的預后差，本實驗生存分析也直接證實了二者在腫瘤中預后的判斷價值。侵襲和轉移是惡性腫瘤生物學行為的重要標志，是導致死亡和影響預后的主要原因之一。實驗結果顯示骨肉瘤中RUNX3和β-catenin的表達呈正相關，提示RUNX3和β-catenin可能有正向協同效應，即RUNX3和β-catenin可能具有通路作用，即RUNX3和β-catenin協同作用時，參與腫瘤細胞外細胞連接的改變，共同促進腫瘤的生長、侵襲和轉移，但是具體的詳細調節機制尚不清楚，有待更多基礎實驗驗證。

總之，流式細胞術檢測RUNX3和β-catenin在骨肉瘤中低表達，二者可能具有協同作用，術后應用流式細胞術檢測RUNX3和β-catenin的表達可能對判斷預后有一定價值。

[參考文獻]

[1]周錢宏，劉愛東. 骨肉瘤組織中MMP-2、MMP-9的表達及意義[J]. 山東醫藥，2009，49（14）： 35-36.

[2]盧燕輝，鄭瑞丹，陳潔，等. 肝癌組織中RUNX3表達及其與臨床病理因素的相關性[J]. 肝臟，2011，16（1）：27-29.

[3]Stein TJ，Holmes KE，Muthuswamy A，et al. Characterization of β-catenin expression in canine osteosarcoma[J]. Vet Comp Oncol，2011，9（1）：65-73.

[4]劉愛東. Kiss-1在胃癌中的表達及意義[J]. 現代中西醫結合雜志，2011， 20（19）：2354-2355.

[5]張剛，黃海濱，羅少軍，等. RUNX3蛋白在瘢痕疙瘩中的表達及其意義[J]. 山東醫藥，2009，49（8）：24-26.

[6]張靜，許光華，張海元. 抑癌基因Runx3增強順鉑致肝癌細胞的凋亡效應[J]. 武漢大學學報（醫學版），2011，32（2）：156-159.

[7]汪洋，林從堯，汪祖春，等. β-catenin和MT1-MMP在結直腸癌組織中的表達及意義[J]. 中華腫瘤防治雜志，2007，14（2）：122-124.

[8]顧國利，魏學明，王石林，等. 大腸癌E-cadherin，β-catenin，MMP-7表達及其臨床意義[J]. 世界華人消化雜志，2007，15（4）：375-380.

[9]馬紅，陳曉，馬海梅，等. E-cadherin、β-catenin和Cathepsin D 在食管鱗狀細胞癌中的表達及其意義[J]. 世界華人消化雜志，2008，16（16）：1757-1762.

（收稿日期：2011-11-22）