IL—32在病理性瘢痕中的表達及其生物學作用研究

李小川等

[摘要]目的：探討IL-32在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的形成過程中所起的生物學作用。方法：收集2009年10月至2011年6月廣東醫學院附屬醫院整形外科手術切除的瘢痕疙瘩組織12例，增生性瘢痕組織12例，正常皮膚24 例，分別應用免疫組織化學技術、RT-PCR和Western Blot檢測IL-32在它們中的表達情況。結果：IL-32在正常皮膚增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中均有表達，在正常皮膚中表達較強，在增生性瘢痕及瘢痕疙瘩組織中表達較弱；IL-32mRNA和IL-32蛋白在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中的表達較正常皮膚明顯降低（P均<0.05），而增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組之間差異無統計學意義 （P>0.05）。結論：IL-32在病理性瘢痕組織的形成過程中起著一定的重要作用，有進一步研究的價值。

[關鍵詞]IL-32；增生性瘢痕；瘢痕疙瘩

[中圖分類號]R619+.6[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）11-1991-03

病理性瘢痕包括瘢痕疙瘩與增生性瘢痕，迄今尚無很好的治療方法，是整形外科臨床面臨的棘手問題之一。1992年Dahl等[1]發現炎性細胞因子人白介素32 （interleukin-32， IL-32），2005年Kim SH等[2] 提出其有很多炎癥反應細胞因子的特性。近來研究證實其不但可誘導炎性細胞因子的產生，而且在調節細胞增殖與凋亡過程中有重要的作用[3]，已經成為腫瘤和結締組織疾病防治研究的重要對象[4]。病理性瘢痕包括瘢痕疙瘩與增生性瘢痕，瘢痕疙瘩具有腫瘤樣生長的生物學特性，且被認為是一種免疫性、炎癥性疾病[5]。IL-32基因是否在病理性瘢痕的發生發展過程中起作用，據筆者所查文獻目前國內外尚未見報道。本實驗旨在通過檢測IL-32在病理性瘢痕組織的表達來初步揭示IL-32 在病理性瘢痕形成中所起的生物學作用，進而從另一角度認識病理性瘢痕的發病機制，可能從分子水平上為瘢痕防治提供新的思路。

1材料和方法

1.1 材料：2009年10月至2011年6月收集廣東醫學院附屬醫院整形外科手術切除的瘢痕疙瘩組織標本12例，其中男性5例，女性7例，年齡17～42歲，平均年齡29.5歲；增生性瘢痕組織標本12例，其中男性4例，女性8例，年齡9～41歲，平均年齡25歲；正常皮膚標本24 例，其中男性17例，女性7例。年齡10～45歲，平均年齡29歲。標本取自先天性畸形、外傷、除皺術及包皮切除患者，取材部位為頭面、胸腹及四肢，瘢痕病變時間3～6個月。所有患者均無慢性疾病史，無長期服用藥物病史，瘢痕未行局部藥物注射治療，并知情同意。

1.2 免疫組化檢測標本中IL-32的表達：常規制備石蠟切片，干燥保存備用。按試劑盒說明書進行免疫組織化學（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結，SP）法，中性樹膠封片。每一批標本均設已知陽性對照和用PBS替代一抗的空白對照，染色結果的判斷以細胞質和細胞膜出現棕黃色或者棕褐色顆粒為陽性染色。按盲法原則分別獨立對實驗結果進行評估。具體判斷標準：采用專業圖像分析軟件IPP6.0對IL-32蛋白的表達進行定量分析。每張切片隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測定每個視野下陽性反應的累積光密度和所有細胞總面積，以每例5個視野的平均光密度作為該例的測量值，平均光密度=陽性反應的累積光密度/細胞總面積。

1.3 RT-PCR檢測IL-32mRNA表達

1.3.1 主要試劑： Trizol 總RNA提取試劑盒、SuperScriptTMIII First-Strand synthesis system for RT-PCR和普通瓊脂糖（大連寶生物工程公司），Pfu DNA Polymerase（Tiangen公司），100bp DNA marker（Santa cruz公司），焦碳酸己二酯（DEPC）、二甲基亞砜（DMSO）、核糖核酸酶A（RNase A）、溴化乙錠（EB）（Sigma公司）。

1.3.2RT- PCR測定

1.4 Western Blot檢測IL-32蛋白的表達：提取組織總蛋白后，用BCA蛋白定量試劑盒測濃度。將標準品按0μl、1μl、2μl、4μl、8μl、12μl、16μl、20μl 加到96孔板的標準品孔中，加PBS補足到20μl，每一濃度做三個復孔。測定A562，計算各濃度蛋白標準的平均吸光度，繪制標準曲線，計算回歸方程。取上述蛋白樣品各20μg，進行SDS-PAGE電泳和Western blot檢測。

1.5 統計學分析：實驗數據統一采用SPSS15.0統計學軟件分析，計量資料結果用均數±標準差（x±s）表示；兩組間差異比較用t檢驗，三組間差異比較用方差分析和q檢驗。P>0.05差異無統計學意義，P<0.05差異有統計學意義。

2結果

2.1 免疫組化檢測結果：IL-32在正常皮膚、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中均有表達（圖1～3），其中在正常皮膚中表達較強，在增生性瘢痕及瘢痕疙瘩組織中表達較弱，增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組IL-32蛋白的相對表達量與正常皮膚相比，其之間差異具有統計學意義（P<0.01），增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組的IL-32蛋白的相對表達量差異無統計學意義（P >0.05）（表1），表明IL-32蛋白的表達與瘢痕的增生有關。

2.2RT-PCR檢測結果：IL-32mRNA的擴增曲線、熔解曲線（圖4），增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組IL-32 mRNA的相對表達量分別比正常皮膚組明顯降低（P均<0.05）；增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組的相比差異無統計學意義（P>0.05）（表2），表明病理性瘢痕中IL-32基因在mRNA水平與正常皮膚差異顯著。

2.3Western Blot檢測結果：電泳結果（圖5、6），可見增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組IL-32蛋白表達較正常皮膚明顯減少。增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組IL-32蛋白的相對表達量分別與正常皮膚相比，其之間差異具有統計學意義（P均<0.05），增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組的IL-32蛋白的相對表達量差異無統計學意義（P>0.05）（表3），說明病理性瘢痕中IL-32基因在蛋白表達水平與正常皮膚差異顯著。

3討論

目前研究發現IL-32的生物學功能如下：①誘導炎癥細胞因子的產生[4]；②是重要的調節細胞增殖與凋亡的基因，如T細胞中IL-32的大量表達可誘導細胞凋亡[6]；③在自身免疫性/炎癥性疾病里起重要的作用[7-10]，如IL-32可誘導多種細胞因子的產生且與多種炎癥性疾病密切相關，是一種前炎癥反應細胞因子，它與疾病的嚴重性程度有關，且在適應性免疫應答和固有性免疫應答中都發揮作用。IL-32基因已被證實可誘導炎癥細胞因子的產生，其是否與增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的發生有關，尚未見文獻報道。

本實驗RT-PCR結果表明IL-32基因在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中表達與正常皮膚相比均明顯減弱（P<0.05），差異有統計學意義，說明IL-32基因在mRNA轉錄水平表達異常。由此推測，在病理性瘢痕的形成過程中可能存在著IL-32基因的缺失、突變或不表達進而導致瘢痕異常增生，提示了IL-32基因在病理性瘢痕的形成過程中起著重要的作用。

免疫組織化學研究結果表明： IL-32蛋白在正常皮膚組織中的表達最強，而在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中的表達均顯著低于正常皮膚中的表達。Western Blot檢測結果進一步明確在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中IL-32蛋白表達量分別與正常皮膚相比明顯減少（P均<0.05），表明IL-32基因在蛋白翻譯水平同樣發生異常。由此推斷， IL-32蛋白在病理性瘢痕中的表達減少可能是由于IL-32mRNA的表達減少而引起或與相關上游的調控蛋白表達異常有關。上述實驗結果揭示IL-32是病理性瘢痕發生發展中的關鍵因素之一，值得進一步深入研究。

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[收稿日期]2012-09-21 [修回日期]2011-11-03

編輯/張惠娟