酶聯免疫吸附實驗檢測HIV抗體影響因素探討

畢秀欣

[摘要] 通過對酶聯免疫吸附實驗檢測HIV抗體的檢測前、檢測中和檢測后各相關影響因素的分析，探討各因素對結果的影響，以便尋找解決的方法和加強質控管理，從而保證檢測結果的準確性和精確性。

[關鍵詞] 酶聯免疫吸附實驗；HIV抗體；影響因素

[中圖分類號] R446.61[文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2012）02-0076-02

The impact factors of enzyme-linked immunosorbent assay in detection of HIV antibodies

BI Xiuxin

International Travel Health Care Center of Dandong in Liaoning Province, Dandong 118000, China

[Abstract] By analysis of all relevant factors in pre-test, during test and post-test of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in detection of HIV antibodies, to explore the various impact factors on the results, in order to find a solution and strengthen the quality control management, to ensure accuracy and precision of the test results.

[Key words] ELISA; HIV antibody; Impact factors

酶聯免疫吸附實驗因其操作簡單、靈敏度高、特異性好、價格低廉等特點成為HIV抗體初篩實驗的常用方法。優質的試劑、良好的儀器、正確的操作和高素質的技術人員是保證檢測結果準確可靠的必要條件。由于ELISA法檢測結果受很多因素影響，其中任何一項因素都可造成HIV抗體結果假陰性和假陽性結果的發生。因此必須加強HIV抗體初篩實驗室的全面質量控制，保證其結果的準確可靠。筆者從事多年的HIV抗體檢測工作，現將影響因素分析如下。

1 檢測前

1.1 試劑

1.1.1 試劑的選擇優質的HIV抗體試劑是結果質量的基礎。試劑要從靈敏度、特異性、精密度、穩定性、簡便性、安全性和經濟性做出全面的評價并選擇好的試劑，根據實驗室要求選擇靈敏度高（精密度高，CV值＜15%）、特異性好的試劑。試劑的選擇很關鍵，通過廠家了解試劑包被物的組成，如原料來源（基因組成或合成多肽）、片段組成（按比例組成或化合組成）、片段長短等來判斷抗原、抗體包被的完整性和特異性。根據試劑批號檢定報告了解其質量水平和試劑的優劣，還可以室間質評報告中對試劑的評價結果來客觀評價、選擇適合實驗室的試劑。要選擇和訂購長效批號的試劑，避免試劑批號改變而重新建立質量控制體系[1]。

1.1.2 試劑的儲存試劑應儲存在2～8℃冰箱中，力求溫度恒定，并防止陽光照射。試劑盒中有3個主要的試劑，即免疫吸附劑、酶結合物和底物。酶結合物具有生物活性，保存不當，極易失活；底物容易被氧化，產生顏色。因此，必須加強試劑的儲存管理，防止試劑失活和氧化。

1.2 標本

血清是最常用的標本。酶聯免疫吸附實驗中標本的質量也是影響結果的關鍵因素之一，標本的干擾物質容易引起假陽性或假陰性的結果。干擾分為外源性和內源性。外源性干擾：細菌污染、溶血、凝固不全、反復凍融和標本相互污染等；標本放置4℃冰箱冷藏一般不超過5 d，如果保存過久，其中的蛋白質可能發生聚合，可使本底加深；凍結的標本要融化后充分混勻，為防止蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分輕輕混勻，避免產生氣泡；渾濁或有沉淀的樣本應先離心澄清后再檢測；防止反復凍融，引起效價降低。內源性干擾：一般包括類風濕因子、補體、高濃度的非特異性免疫球蛋白、異嗜性抗體及某些自身抗體等，避免內源性干擾因素主要通過選擇合適的試劑。①標本溶血時釋放大量具有過氧化物酶活性的物質，增加了非特異顯色，干擾測定結果[2]；②標本被細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP，也會產生假陽性反應；③血清標本應充分離心，否則可因凝固不全、纖維蛋白原非特異吸附于微孔內而造成假陽性結果。

1.3 儀器

酶聯免疫吸附實驗中會用到移液器、水浴箱或恒溫箱、洗板機、酶標儀等。移液器是一種比較精密的工具，要求比較高，必須定期對加樣器進行維護和校準[3]。每次加樣需更換吸嘴，以免交叉污染。水浴箱溫度要準確恒定；洗板機要定期維護，檢測殘液量。

2 檢測中

2.1 加樣

在HIV抗體檢測中加樣3次，即加標本、加酶結合物、加底物。加樣時要將所加物加入板孔底部，避免加在孔壁外部，產生氣泡，吸取樣品速度要均勻，保證加樣量準確；加完樣品要在微量振蕩器上震蕩1min以保證混合均勻。

2.2 溫育的時間和溫度

要力求保證溫育的時間和溫度，酶聯免疫吸附實驗屬于固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相的表面發生，樣品中的抗體并不是都有均等的機會與固相的抗原結合，而是最貼近孔壁的一層溶液中的直接與抗原接觸，是一個逐漸平衡的過程，因此需要經過擴散才能達到反應的終點，要保證足夠的溫育時間，才能使產物生成達到頂峰，有的實驗室為加快速度，提高反應溫度，但盲目提高溫度會影響酶的活性。

2.3 溫育的方式

常采用溫箱法、微波輻射法和水浴法。其中水浴法能較好地解決因受熱不均衡所致周圍孔與中央孔結果的吸光度差異（即邊緣效應），可將ELISA板置于水浴箱中。無論溫育還是水浴，反應板不可疊放，以保證各板的溫度盡快達到平衡，反應板要貼近水面，溫育時要防止揮發或水珠濺入影響結果。

2.4 洗滌

洗滌雖然不是一個反應步驟，但也影響實驗的成敗。洗滌的目的是分離游離和結合的酶標記物，通過洗滌來實現清除殘留在板孔中的沒能與固相抗原結合的物質以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質，洗液的配制要按照要求，太濃會解離包被在固相的抗原，過低削弱洗滌效果。可以說洗滌是HIV抗體ELISA法檢測的最主要的技術，操作者要嚴格按照要求洗滌，不能馬虎，否則前功盡棄。洗滌包括儀器自動洗滌和手工洗滌。儀器洗滌要注意定期檢測殘余量，檢測吸液針和注液針是否堵塞，及時更換洗液和廢液，防止時間過長引起細菌污染和廢液倒流；手工洗滌包括有浸泡式和流水沖洗式兩種。手工洗板要注意孔間的交叉污染和洗滌間隔時間。

2.5 顯色與比色

顯色是ELISA法中最后一步溫育反應，反應時間和溫度仍是影響顯色的因素。TMB受光照影響不大，但OPD底物受光照會自行變色，因此，顯色反應應避光進行。顯色的溫度和時間要力求準確充分，并在規定的時間內比色，防止時間過長會褪色。比色時應盡量選用雙波長進行比色，這樣可以排除干擾，比色前要用吸水紙拭干板底附著的液體，防止孔內產生氣泡，對測定結果產生干擾。

3 質量控制

3.1 開展室內質量控制（IQC）

室內質量控制程序，每次或每天之間不可能沒有誤差，決定允許的誤差范圍以臨床上不造成誤診和漏診為準，選擇一個弱陽性的室內質量控制品，其S/CO值應該為2～4之間。利用L-J質量控制圖，認真分析每次的失控的原因，要解決失控，必須分析造成失控是隨機的還是系統的很重要，隨機誤差表現離散度增大，而系統誤差逐漸產生，如漂移或者傾向性，如果是系統誤差，再對系統誤差進行分析。實驗室每月、每一季度要對室內質量控制結果進行分析總結，對當月的均值、變異系數等進行比對分析，及時發現問題，及時采取糾正措施來提高檢測結果的可靠性。

3.2 外部質量控制

積極參加室間質評能力驗證活動，通過室間質評和能力驗證，利用實驗室間比對來確定實驗室檢測或校準能力的活動，判斷和監控實驗室內部質量控制方法，有效消除偏差，對分析結果起到校準和復核作用。有效地實施能力驗證，在實驗室質量控制中起著非常重要的作用。利用實驗室間的比對和能力驗證來不斷提升實驗室的能力。

3.3 加強人員培訓

人員是實驗室最寶貴的資源，一個實驗室水平的高低很大程度上取決于人員的素質，尤其是關鍵的技術崗位人員，因此，有針對性地加強人員培訓，對艾滋病初篩實驗室是非常重要的[4]。

[參考文獻]

[1]于振喜，李連潔. 用ELISA法檢測HIV抗體時如何避免“花板”[J]. 中國醫藥導報，2006，3（23）：56.

[2]陳云鈺. ELISA法檢測HIV抗體需注意的影響因素[J]. 中國衛生檢驗雜志，2011，21（6）：1564-1565.

[3]全國艾滋病檢測技術規范（2009年修訂版）[S]. 中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心，2009：1-5.

[4]張斌. 實驗室管理、認可與運作[M]. 北京：中國標準出版社，2005：162-164.

（收稿日期：2011-11-18）