慢性乙型重型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TRAIL mRNA水平的臨床研究

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摘 要 目的：探討慢性乙型重型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）mRNA的水平變化及其臨床意義。方法：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)檢測實(shí)驗(yàn)組和健康對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞TRAIL mRNA的水平，比較實(shí)驗(yàn)組和健康對(duì)照組之間TRAIL mRNA水平差異。結(jié)果：慢性乙型重型肝炎患者PBMC TRAIL mRNA的水平明顯高于健康對(duì)照組（P<001），實(shí)驗(yàn)存活組PBMC TRAIL mRNA水平明顯高于實(shí)驗(yàn)死亡組（P<001）。結(jié)論：TRAIL在慢性乙型重型肝炎病理損害過程中起著重要的作用。

關(guān)鍵詞 慢性乙型重型肝炎 外周血單個(gè)核細(xì)胞 可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體

doi：10.3969/j.issn.1007—614x.2012.29.189

Abstract Objective：To explore the role of TRAIL in the pathogenesis of HBV infection in CHB severe hepatitis.Methods：The expression of membrane—bound TRAIL in peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）was examined by real—time fluores—cence quantitative PCR.Results：The levels of TRAIL mRNA in PBMCs were significantly higher in CHB severe hepatitis than in normal controls（P<001）.Conclusion：TRAIL—mediated apoptosis probably is one of the mechanisms for liver damage in the pathogenesis of severe hepatitis.

慢性乙型重型肝炎屬于乙肝病毒感染所致的免疫介導(dǎo)性疾病。研究表明許多凋亡分子參與了重型肝炎肝臟病理損傷過程，如Fas/Fas配體系統(tǒng)、TNF—α/TNF—R1系統(tǒng)、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）受體/配體系統(tǒng)等，而TRAIL受體/配體系統(tǒng)的作用日益引起關(guān)注¹。為進(jìn)一步探索慢性乙型重型肝炎患者外周血PBMC的TRAIL mRNA水平與重型肝炎肝臟病理的關(guān)系，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)檢測慢性乙型重型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TRAIL mRNA的水平并進(jìn)行相關(guān)性分析。

資料與方法

2011年5月～2012年3月收治慢性乙型重型肝炎患者22例，診斷參照2000年西安全國病毒性肝炎會(huì)議修訂的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除其他類型的病毒性肝炎或其他原因的肝病。其中男16例，女6例，年齡20～60歲。20例本院健康體檢者作為健康對(duì)照。應(yīng)用TRIzol提取液、pGEMT—Easy載體、質(zhì)粒提取試劑盒、dNTPS、Super—Script TMⅢ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)檢測PBMC TRAIL mRNA的水平：按TriZol試劑說明書抽提慢性乙型重型肝炎患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞總的RNA，按Super—Script TMⅢ試劑說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA分子。以適量cDNA為模板，PCR擴(kuò)增TRAIL基因片斷。TRAIL上下游引物為5′—CCCAATGACG AAGAGAGTATGAAC—3′。5′—TGTA GAA ATGGTTTCCTCAGAGGT—3′。2M上下游引物為5‵—TCCATCCGACATTGAAGT TGAC—3′、5′—ACTATCTTGGGCTGTGACAAAG—3′。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃ 3分鐘、94℃ 30秒、56℃ 30秒、72℃ 30秒共35個(gè)循環(huán)，72℃ 5分鐘。擴(kuò)增均設(shè)置陰性對(duì)照。根據(jù)各自標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，由軟件自動(dòng)分析測定樣本中TRAIL含量。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：求得各組結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示樣本水平。采用方差齊性比較兩樣本均數(shù)間差異，如方差相等則利用t檢驗(yàn)進(jìn)行，指標(biāo)間相關(guān)性采用直線相關(guān)分析。

結(jié) 果

慢性乙型重型肝炎患者PBMC TRAIL mRNA水平明顯高于健康對(duì)照組（P<0.01）。患病組22例按預(yù)后分為存活組和死亡組。存活組血清PBMC TRAIL mRNA水平明顯高于死亡組血清PBMC TRAIL mRNA水平（P<0.01）。見表1。

討 論

細(xì)胞凋亡與重型乙型肝炎發(fā)病機(jī)制的關(guān)系正受到人們的重視。許多凋亡分子已被發(fā)現(xiàn)參與此過程。TRAIL為繼TNF、FasL之后發(fā)現(xiàn)的第3個(gè)TNF超家族的凋亡分子。Mundt等發(fā)現(xiàn)²，腺病毒感染鼠肝炎模型中，腺病毒感染可以激活TRAIL誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，并推測TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能在病毒性肝炎中發(fā)揮重要作用。他們還發(fā)現(xiàn)HBV感染的患者肝組織TRAIL表達(dá)增高。

TRAIL被認(rèn)為是機(jī)體有效的免疫監(jiān)視分子³，在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)和腫瘤凋亡中起著重要的作用。本試驗(yàn)表明慢性乙型重型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TRAIL mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，高于正常對(duì)照組，提示在慢性乙型重型肝炎病理損害過程中同樣存在TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，TRAIL水平能敏感地反映患者的肝臟損傷程度。我國重型肝炎主要是由于病毒感染所致，慢性乙型重型肝炎屬于乙肝病毒感染所致的免疫介導(dǎo)性疾病，TRAIL受體/配體系統(tǒng)及其他眾多的凋亡分子在病理狀態(tài)下被激活參與機(jī)體的免疫反應(yīng)。HBV激活TRAIL的表達(dá)，在細(xì)胞因子的作用下，能夠及時(shí)清除突變細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞，限制病毒復(fù)制對(duì)機(jī)體起著重要的防衛(wèi)作用⁴。但同時(shí)TRAIL也存在損傷肝臟，破壞肝細(xì)胞的可能性，在殺傷靶細(xì)胞的同時(shí)也有可能加劇肝臟的損傷。肝細(xì)胞破壞增多，肝臟的解毒功能下降，從而使體內(nèi)內(nèi)毒素（LPS）降解減少。腸源性內(nèi)毒素進(jìn)入體循環(huán)，又刺激外周血免疫細(xì)胞如單個(gè)核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，使其表達(dá)TRAIL增多，PBMC TRAIL mRNA表達(dá)增