基于早實核桃不同品種葉片組織結構的抗寒性劃分

摘 要: 為研究早實核桃品種的抗寒性，以14個早實核桃品種為試材，采用印跡法和石蠟制片技術觀測了10項葉片組織結構指標，應用變異系數、相關分析和聚類分析對葉片組織結構指標進行了篩選，采用隸屬函數對各品種的抗寒性進行了綜合評價。結果表明，葉片厚度、氣孔密度和柵/海比是影響抗寒性的主要葉片組織結構指標；14個品種抗寒性強弱排序為: 西林2號>契可>溫185>強特勒>維納>魯光>吐來爾>遼核3號>遼核4號>西扶2號>中林5號>遼核1號>香玲>西林3號。抗寒性類型劃分為5類: 西林2號為高抗寒類型；契可和溫185為抗寒類型；強特勒、維納、魯光、吐來爾、遼核3號和遼核4號為中抗寒類型；西扶2號、中林5號和遼核1號為低抗寒類型；香玲和西林3號為不抗寒類型。

關鍵詞: 早實核桃； 葉片組織結構； 抗寒性； 綜合評價

中圖分類號：Ｓ６６4．1 文獻標志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０（２０12）０2－0205－０7

Cold resistance division based on leaf tissue structure of early-fruiting walnut cultivars

LIU Du-ling1， ZHANG Bo-yong1， PENG Shao-bing1，ZHU Hai-lan1，LIU Shu-ming2*， DU Ting1

（1College of Forestry， Northwest A F University， Yangling， Shaanxi 712100 China； 2College of Science， Northwest AF University， Yangling， Shaanxi 712100 China)

Abstract: To study cold resistance of early-fruiting walnut cultivars， 14 early-fruiting varieties were used as experimental materials， and 10 leaf tissue structure indexes were observed by using blotting methods and paraffin section methods. Leaf tissue structure indexes were screened via coefficient of variation， analysis of correlation and hierarchical cluster analysis， and comprehensive evaluation on cold resistance for each variety was done by subordinate function . The results showed that leaf thickness， stomata density and the ratio between palisade tissue and spongy tissue were the main factors related to the hardiness；the cold resistance for 14 cultivars was in order of Xilin No. 2>Chico>Wen185>Vina>Chandler >Liaohe No. 3> Tulare >Luguang>Liaohe No.4>Xifu No. 2>Zhonglin No. 5>Xiangling>Xilin No. 3>Liaohe No. 1；according to the cold hardiness， the cultivars could be divided into 5 groups: Xilin No. 2 with high cold resistance; Chico and Wen185 with cold resistance ; Chandler， Vina， Luguang， Tulare， Liaohe No. 3 and Liaohe No.4 with medium cold resistance；Xifu No. 2， Zhonglin No. 5 and Liaohe No.1 with low cold-tolerance; Xiangling and Xilin No. 3 without cold resistance.

Key words: Early-fruiting walnut； Leaf tissue structure； Cold resistance； Comprehensive evaluation

核桃（Juglans regia L.）是主要的干果和木本油料樹種， 是我國重要的傳統出口商品。核桃果實營養豐富，其營養價值和保健作用越來越為人們所認識。隨著人們生活水平的不斷提高，對核桃的需求量日趨增多，核桃栽培面積迅速擴大。但我國北方核桃產區普遍存在倒春寒、晚霜危害，使核桃雌、雄花芽、幼嫩新梢嚴重受凍，造成核桃產量大幅度降低甚至絕收[1-2]，嚴重地制約著核桃產量和經濟效益的提高，進而影響核桃生產的發展。因此，研究核桃的抗寒性，對于今后核桃生產的發展具有重要的意義。我們對14個早實核桃品種進行葉片解剖結構觀測比較，綜合評價早實核桃不同品種的抗寒性，旨在為核桃抗寒品種選育、引種栽培及適栽區劃分提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

試材為早實核桃14個品種: 西林2號、西林3號、遼核1號、遼核3號、遼核4號、西扶2號、中林5號、溫185、香玲、魯光、維納、契可、吐來爾和強特勒，樹齡5～7 a，環境條件、管理條件基本一致。

1.2 方法

1.2.1 采樣及處理 于2009年7月16日在興平市馬嵬鎮核桃良種采穗圃，每品種選擇3個生長勢基本一致的單株，在每單株樹冠同方向、同部位摘取同一節位充分成熟的小葉5枚（共15枚）。每個品種取5枚葉片用于氣孔觀察，其余10枚以主脈中部為中心，切取1 cm×1 cm小塊，FAA液固定，后保存于70%的酒精中備用。

1.2.2 石蠟制片及葉片解剖結構觀測 采用石蠟切片法制片[3]，酒精梯度脫水，浸蠟包埋，用LeicaRM切片，切片厚度8 μm，番紅-固綠雙重染色，中性樹膠封藏，制成裝片。裝片用Motic顯微鏡及Motic顯微成像系統觀察，20倍鏡下照相。利用圖像處理軟件Photoshop CS 3.0按像素測定其葉片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度（單位: μm），計算柵/海比、細胞結構緊密度（CTR）和細胞結構疏松度（SR），所有測量數據均為30個視野的平均值。計算公式為:

柵/海比=柵欄組織厚度/海綿組織厚度

細胞結構緊密度（CTR）=柵欄組織厚度/葉片厚度×100

細胞結構疏松度（SR）=海綿組織厚度/葉片厚度×100

1.2.3 葉表皮制片及氣孔觀測 采用印跡法[4]制片，中性樹膠封片。用Motic顯微鏡及Motic顯微成像系統觀察， 40倍鏡下照相。利用圖像處理軟件Photoshop CS 3.0按像素進行測量，觀測氣孔長度（APL）和氣孔密度（SD），每個觀測指標值均為30個視野的平均值。

氣孔長度（APL）——氣孔器兩個腎形保衛細胞結合處的長度（ μm）。

氣孔密度（SD）——每個視野單位面積氣孔器的個數（個/mm2）。

1.2.4 數據分析 數據分析采用Excel和 SPSS 17.0軟件進行。

2 結果與分析

2.1 早實核桃不同品種葉片組織結構特征比較

2.1.1 早實核桃不同品種葉肉組織結構特征比較

葉片厚度常作為植物抗寒性指標之一，越厚則水分散失越慢，在寒冷的外界環境下可延緩葉片受低溫的損害程度。由表1可看出，各品種葉片厚度254.17~364.15 μm，品種間葉片厚度差異極顯著，不同品種葉片厚度由大到小依次為: 遼核1號>西林2號>強特勒>遼核4號>維納>溫185>魯光>遼核3號>西扶2號>中林5號>吐來爾>西林3號>契可>香玲。

從核桃葉片橫切面圖可見（圖版Ⅰ），各品種葉肉細胞有明顯柵欄組織和海綿組織分化，為典型的異面葉。靠近軸面的柵欄組織細胞為長柱狀，細胞間隙較小，細胞分層排列緊密且較規則。海綿組織細胞位于柵欄組織和下表皮之間，多為短柱狀，相互連接成網，但排列密集程度各品種不一。柵欄組織細胞內含葉綠體數目較多，分布也比較均勻，海綿組織細胞內葉綠體數目相對較少。

從測定結果看出（表1），14個核桃品種的葉肉組織結構指標之間均存在極顯著差異。早實核桃多數品種柵欄組織為2層（吐來爾、契可、強特勒為2～3層），第1、2層柵欄組織細胞排列緊密，第3層細胞排列相對疏松，與海綿組織區分不太明顯。柵欄組織厚度117.5~160.4 μm，平均厚度為140.08 μm。溫185柵欄組織厚度最大，在 160 μm以上，香玲和西林3號最小，不到120 μm。各品種海綿組織均排列疏松（圖版Ⅰ）。海綿組織厚度89.10~162.80 μm，平均厚度為118.62 μm，西林3號海綿組織最厚，為162.80 μm，契可海綿組織厚度最小，海綿組織細胞排列明顯比其他品種密集。

各品種柵/海比為0.90~1.49，契可柵/海比最大，為1.49，遼核1號最小，為0.90。CTR值為0.52~0.40，溫185的CTR值最大，遼核1號最小。SR值為0.34~0.45，遼核1號SR值最大，契可最小。

2.1.2 早實核桃不同品種表皮組織結構特征比較

表皮是植物的保護組織，是植物抵御不良環境的屏障[5]。表皮包括上表皮和下表皮。由圖版Ⅱ可知，早實核桃表皮均由單層細胞構成，其外被角質層，上表皮細胞扁平方形，排列緊密，下表皮細胞不規則，沒有空隙。從測定結果表1看，早實核桃各品種葉片表皮特征各異。除遼核3號、西扶2號、溫185、香玲外，其他品種的上表皮均厚于下表皮；各品種上、下表皮厚度差異極顯著；上表皮厚度28.27~15.35 μm，遼核1號上表皮明顯厚于其他品種，西林3號上表皮明顯薄于其他品種；下表皮厚度21.17~11.49 μm，香玲下表皮最厚，西林3號最薄。早實核桃上表皮沒有氣孔分布，下表皮散生有大量氣孔。氣孔平置，為不定式， 卵圓形或長圓形。氣孔器由2個腎形的保衛細胞構成，形狀相似（圖版Ⅱ）。各品種的氣孔特征存在極顯著差異（表1），早實核桃氣孔器形小而密集，平均長度為32.84 μm，平均密度為227.30個·mm-2。西林2號和吐來爾氣孔最長（在35.00 μm以上），遼核3號氣孔最短（在 30.00 μm以下）。遼核1號和西扶2號的氣孔密度最大（在290.00個·mm-2以上），西林2號和契可的氣孔密度最小（在150.00個·mm-2以下）。

2.2 早實核桃品種抗寒性綜合評價

2.2.1 葉片抗寒性組織結構指標篩選 只有選擇彼此獨立的、具有代表性的指標才能獲得抗寒性評價的最優方案。對14個早實核桃10項葉片解剖結構指標進行聚類分析。

從圖1可以看出，10項葉片組織結構指標聚為3類時，各類間的距離比較大，說明各類特點比較突出，相關性較小。第1類包括葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、葉片組織結構疏松度（SR）、上表皮厚度和氣孔長度（APL）；第2類包括下表皮厚度和氣孔密度（SD）；第3類包括柵/海比和葉片組織結構緊密度（CTR）。各類中典型指標的選擇根據相關指數的大小確定，相關指數計算公式為:

R2i為每類中每個指標的相關指數，n為每類中指標個數，i=1，2，…n， r為同類中某指標與其他指標間的相關系數（表2）。指標的相關指數越大，代表性越強。

根據統計學原理，如果選入了葉片結構變異過小的指標，不僅不會使分析結果準確、合理，反而給分析帶來不便。一般在一組指標中變異系數大的指標對分析結果具有重要意義。由表3知，第1類中，葉片厚度的相關指數最大，確定為該類的典型指標；第2類中，下表皮厚度與氣孔密度相關指數相等，氣孔密度變異系數，17.84%（表1）較大，故選氣孔密度；第3類中，柵/海比和CTR相關指數相等（表3），但柵/海比的變異系數大，12.45%（表1），故選擇柵/海比。

2.2.2 早實核桃不同品種抗寒性綜合評價 對篩選的3項葉片抗寒性解剖結構指標（葉片厚度、氣孔密度、柵/海比），應用隸屬函數法，對早實核桃14個品種的抗寒性進行綜合評價。隸屬函數值計算公式為:

Uij式中表示i種類j指標的抗寒隸屬函數值；Xij表示i種類j指標的測定值；Xjmim表示所有種類j指標的最小值；Xjmix表示所有種類j指標的最大值；i表示某個品種；j表示某項指標。如果某一指標與核桃抗寒性呈負相關， 則利用反隸屬函數進行轉換， 計算公式為:

根據此公式計算出各品種3項指標的平均隸屬度，以平均隸屬度評價早實核桃品種的抗寒性，平均隸屬度越大，抗寒性越強。

按平均隸屬度大小（表4），對早實核桃品種抗寒性強弱排序為: 西林2號>契可>溫185>強特勒>維納>魯光>吐來爾>遼核3號>遼核4號>西扶2號>中林5號>遼核1號>香玲>西林3號。按照平均隸屬度將14個早實核桃品種抗寒性劃分為5類: 0.70~1.00為高抗寒類型（High Resistance， HR）， 有西林2號；0.60~0.69為抗寒類型（Resistance， R）， 有契可和溫185；0.40~0.59為中抗寒類型（Middle Resistance， MR），有強特勒、維納、魯光、吐來爾、遼核3號和遼核4號；0.30~0.39為低抗寒類型（Lower Resistance， LR）， 有西扶2號、中林5號和遼核1號；0~0.29為不抗寒類型（Susceptible， S），有香玲、西林3號。

3 討 論

關于植物形態組織結構與抗寒性的關系，早在1904年Blinn[6]就指出，可根據品種之間形態差異來區分其抗寒性。葉是植物抗寒最敏感的器官，有關葉片形態組織結構與抗寒性關系的研究在許多經濟林樹種[5，7-9]已有報道。一般認為，CTR 、SR和柵/ 海比是指示抗寒性強弱的重要指標。 CTR、柵/ 海比與抗寒性呈正相關，SR與抗寒性呈負相關[8-10]。本研究應用相關分析、變異系數和聚類分析從10項葉片解剖結構指標中選擇出指示早實核桃抗寒性的3項指標: 氣孔密度、葉片厚度和柵/海比。氣孔密度作為抗寒性指標與李國華等[5]在澳洲堅果上的研究結果一致，柵/海比作為抗寒性指標與吳林等[7]在越橘、王奎玲等[9]在耐冬山茶上的研究結果一致，而葉片厚度作為抗寒性指標與前人[5，8]的研究結果不一致。李國華等[5]和彭偉秀等[8]認為，單一組織的數量（如葉片總厚度、柵欄組織厚度或海綿組織厚度） 往往會隨樣品所處生態條件和生理狀態的不同而發生變化，沒有一定的穩定性， 不能很好反映品種間抗寒性在遺傳上的差異， 作為不同品種抗寒性的形態學指標可靠性不強。因此，葉片厚度作為早實核桃抗寒性指標還有待于進一步研究。

本研究應用隸屬函數法，對14種早實核桃品種的抗寒性進行了綜合評價， 其強弱排序為: 西林2號>溫185>契可>維納>強特勒>遼核3號>吐來爾>魯光>遼核4號>西扶2號>中林5號>香玲>西林3號>遼核1號。根據平均隸屬度將14個品種劃分為5個抗寒類型。第1類為高抗寒類型，有西林2號；第2類為抗寒類型，有契可和溫185；第3類為中抗寒類型，有強特勒、維納、魯光、吐來爾、遼核3號和遼核4號；第4類為低抗寒類型，有西扶2號、中林5號和遼核1號；第五類為不抗寒類型，有香玲、西林3號。

抗寒性是從植物形態解剖構造，水分生理生態特征及生理生化反應到組織細胞，光合器官乃至原生質結構特點的綜合反映[11]。因此只有從其抗寒形態結構特征、抗寒生理生化特征及核桃的生長狀況等方面，采用多指標綜合評價，才能客觀地反映核桃的抗寒性[12-13]。本研究利用篩選的3項葉片解剖結構指標對早實核桃抗寒性進行了初步評價，要準確評價核桃的抗寒性，還需結合抗寒生理生化指標，田間凍害情況及凍害后生長恢復情況等加以綜合考慮。

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