基于EST-SSR標記分析獼猴桃種質遺傳關系

摘 要: 利用開發的11對EST-SSR引物分析了33份獼猴桃種質資源的遺傳多樣性及其遺傳關系。結果表明，11對EST-SSR引物在所有供試材料中均可擴增出清晰條帶，其中有8對引物呈現多態性，多態性擴增率為72.7%，對33份種質材料的區分率達100 %。8對多態性引物共檢測到61個等位基因，每對引物可檢測到的等位基因數為2-17，平均為7.6個。利用NTSYS-pc軟件，以不加權成對算術平均法（UPGMA）對擴增結果進行聚類，譜系圖顯示，33份種質材料之間的相似系數在0.60～0.97，表明獼猴桃種質之間遺傳關系相對來說不是很遠。在相似系數0.73的水平上可將供試獼猴桃材料分為7個類群，其結果與傳統的形態分類大體一致。從分子角度揭示了獼猴桃種質資源的遺傳多態性及其遺傳關系。可為獼猴桃種質改良提供理論依據。EST-SSR是非常有效和可靠的分子標記，可為獼猴桃分子育種及遺傳連鎖圖構建奠定基礎。

關鍵詞: 獼猴桃； EST-SSR； 種質資源； 遺傳分析

中圖分類號：Ｓ６６3．4 文獻標志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０（２０12）０2－0212－０5

Genetic relationships from Kiwifruit germplasms based on EST-SSR markers

XU Xiao-biao，LIAO Jiao，HUANG Chun-hui，GU Qing-qing，QU Xue-yan，LIU Shan-jun，CHEN Jin-yin

（College of Agronomy，Jiangxi Agricultural University，Nanchang， Jiangxi 330045 China）

Abstract: Eleven pairs of EST-SSR markers developed and designed by our lab were used to amplify the genomic DNA isolated from 33 kiwifruit genotypes (Actinidia spp.) in order to analyze their genetic diversity and relationship. The results showed that the clear DNA fragments were amplified for all materials tested by using 11 pairs of EST-SSR primers， and 8 of them showed polymorphic， accounting for 72.7%， the identification rates of 33 germplasms were up to 100%. Totally， 61 alleles were detected by 8 polymorphic pairs of EST-SSR primers， and 2 to 17 (mean 7.6) by each polymorphic primer set. Then Cluster analysis results by NTSYS-pc software based on Unweighted pair-group method arithmetic average (UPGMA) showed that the Dice similarity coefficients of 33 germplasms in kiwifruit ranged from 0.60 to 0.97， which suggested that their genetic relationships were relatively near. Thirty three accessions could be divided into seven groups according to the Dice similarity coefficient 0.73， which was consistent with the traditional classification to a certain degree. The research could reflect the kiwifruit genetic variation on molecular level by EST-SSR markers and provide theoretical basis for kiwifruit breeding. It is suggested that EST-SSR markers are very effective to evaluate DNA polymorphism and genetic diversity in kiwifruit germplasms，and will provide theoretical information for molecular breeding and genetic mapping in kiwifruit.

Key words: Kiwifruit （Actinidia spp.）； EST-SSR； Germplasm resources； Genetic analysis

獼猴桃（Actinidia Lindl.）是20世紀野生果樹人工馴化栽培最有成就的四大果種之一[1]。由于其風味獨特，營養豐富，維生素C含量高，經濟價值和醫療效果好， 被譽為“果中之王”，深受消費者青睞。雖然獼猴桃產量的提高與品質的改善在相當程度上依靠品種更新，但在生產上優良品種推廣滯后，品種間遺傳背景狹窄，遺傳資源多樣性受到不同程度的破壞。因此，進行獼猴桃種質遺傳多樣性研究對于良種選育與產業可持續發展具有重大意義。

近年來，國內外學者分別運用SSR[2-4]、RAPD[5]、AFLP[6]等分子標記技術對獼猴桃種質遺傳多樣性與親緣關系進行了相關研究。此外。寧允葉等[7]利用RAPD技術對紅陽獼猴桃資源進行了分析，并篩選鑒定了全紅芽變系。董曉莉等[8]采用RAPD技術研究彩色獼猴桃與美昧獼猴桃的遺傳多樣性，結果表明彩色獼猴桃和美昧獼猴桃具有復雜的遺傳關系，它們除了變種間具有較大的遺傳差異外，變種內也存在一定的遺傳差異。UPGMA法聚類結果與傳統的形態分類存在一定的差異．但部分反映了獼猴桃的地理分布。CHEN等[9]從64對AFLP引物篩選出4對引物，對31份獼猴桃種質材料進行檢測，得到190個擴增基因位點，其中多態性位點179個，多態性比例為94.2%，對31份種質材料的區分率達到100 %。然而，由于獼猴桃開發的分子標記種類和數量有限，故尚需開發更多的分子標記類型應用于獼猴桃種質遺傳多樣性和遺傳圖譜等研究。

目前，新型的EST-SSR標記已成為重要農藝性狀定位、基因作圖、遺傳多樣性、比較基因組學研究的新型重要工具[10]。EST-SSR標記具有信息量大、通用性好、開發簡單快捷、費用低等優點，是一種有效和可靠的分子標記。在一些果樹中已建立了EST-SSR標記，并被證明具有多方面的利用價值和功能性[11]。但EST-SSR 標記在獼猴桃種質資源遺傳多樣性方面的研究尚未見報道。據此，本研究應用EST-SSR標記對獼猴桃種質資源進行分析，篩選獼猴桃多態性的分子標記，揭示其遺傳多樣性水平，以期為獼猴桃資源保育與遺傳改良奠定理論基礎。

1 材料和方法

本試驗采取了33份獼猴桃種質（表1）進行遺傳多樣性評價與遺傳關系分析，供試材料均采自中國科學院武漢植物研究所獼猴桃國家種質資源圃。

采集新鮮嫩葉用硅膠干燥保存提取基因組DNA，采用CTAB法[12]加以改進[13]。在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳檢測DNA質量，將DNA模板濃度調至10 mmol·L-1，-20 ℃保存備用。PCR反應為20 μL 反應體系，含2. 0 mmol·L-1 Mg2+，0. 25 mmol·L-1 dNTP，0.3 μmol·L-1的引物，60 ngDNA，Taq DNA 酶1U。反應程序為: 94 ℃預變性3 min，然后進入循環，94 ℃變性30 s，適宜溫度退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，循環次數為35。72 ℃延伸240 s，4 ℃保存。擴增產物用8%丙烯酰胺凝膠電泳檢測，硝酸銀染色顯影，掃描圖像保存至電腦。50 bp DNA ladder為參照，估算擴增產物分子量。

分析丙烯酰胺凝膠電泳圖片，圖譜中的每一條帶（DNA片段）作為一個分子標記，每條多態性帶可視為一個等位基因，根據各分子標記的遷移率及其有無計算所有位點的二元數據，有帶記為“1”，無帶記為“0”。輸入生成矩陣，計算各獼猴桃種間的遺傳相似系數。利用NTSYS-pc軟件對數據進行分析，以不加權成對算術平均法（UPGMA）對材料進行聚類。

2 結果與分析

2.1 引物的多態性及其揭示的遺傳多樣性

利用本實驗室開發的11對EST-SSR引物對33份獼猴桃材料進行分析，發現其在所有供試材料中均可擴增出清晰條帶，有效擴增率為100%。其中有8對引物（Acd05、Acd08、Acd11、Ad002、Acd001、Acd035、Acd037、Acd083）呈現多態性，多態性擴增率為72.7%。

進一步運用該8對多態性EST-SSR擴增引物對33份獼猴桃種質的遺傳多樣性及其遺傳關系進行評價與分析。結果表明，供試的8對EST-SSR引物擴增多態性明顯，在33份獼猴桃材料中共檢測出61個等位變異（表2）。每對引物所揭示的等位基因數明顯不同，所檢測的等位基因數變化于2~17之間，平均為7.6個。

2.2 獼猴桃種質資源的聚類分析

根據材料間的相似系數，采用UPGMA法對33份獼猴桃種質進行聚類（圖1）。在遺傳相似系數為0.73的水平上可將33份獼猴桃材料聚為7類，其中粗葉獼猴桃單獨聚在為類（A類），葛棗獼猴桃、黒蕊獼猴桃、軟棗獼猴桃聚在一類（B類）。禿果毛花獼猴桃、毛花獼猴桃及白色毛花獼猴桃聚為一類（C）。網脈獼猴桃、黃毛獼猴桃、小葉獼猴桃及闊葉獼猴桃聚為一類（D）。刺毛獼猴桃、中越獼猴桃、紫果獼猴桃及白背葉獼猴桃為一類（E）。F類包括棕毛獼猴桃、狗棗獼猴桃、梅葉獼猴桃、四萼獼猴桃、大籽獼猴桃、對萼獼猴桃及團葉獼猴桃。其余材料聚為G類。在G類中，異色獼猴桃與京梨獼猴桃、漓江獼猴桃與大花獼猴桃親緣關系較近。硬齒獼猴桃的變種異色獼猴桃與京梨獼猴桃聚為一類，但未能與硬齒獼猴桃的另一變種毛葉硬齒獼猴桃聚為一類，說明該種內具有較大的遺傳變異，這與該種在形態上較復雜的多態性相一致。

3 討 論

目前，作為一種新型的EST-SSR標記，已在葡萄[14]、梨[15]、柑橘[16]、扁桃[17]、香蕉[18]等多種果樹的遺傳多樣性和系統學研究、獼猴桃[19]連鎖標記篩選、蘋果[20]、草莓[21]、柑橘與枳殼[22]、以及獼猴桃[23]遺傳圖譜構建等方面有相關研究。本研究中采用優越而高效的基于EST的SSR標記技術，對33份獼猴桃種質資源的遺傳多樣性進行分析。其中篩選出8對EST-SSR引物呈現多態性，多態性擴增率為72.7%，對33份供試材料的區分率達100%，共檢測到61個等位基因，每對引物可檢測到的等位基因數為2~17種。通過UPGMA聚類，在遺傳相似系數為0.73的水平上可將33份獼猴桃材料聚為7類，其結果與傳統的形態分類大體一致。本實驗采用11對EST-SSR引物對33份獼猴桃種質進行遺傳多樣性分析，其中有8對引物在供試材料中都有擴增產物，且均能擴增出多態性，可能由于引物設計時選用了SSR重復次數較高的EST，這就增大了引物在不同材料間的多態性擴增率，提高了EST-SSR標記在資源分析中的效率。研究結果從分子水平上解釋了這些種質資源的遺傳多樣性水平。

中國是獼猴桃的起源和分布中心，種質資源極為豐富[24]。全世界獼猴桃共有75種，125個分類群（變種或變型）[25]。傳統的形態學分類將獼猴桃屬植物分為4類，分別是凈果組、斑果組、星毛組和糙毛組[26]。本研究在D=0.73的水平上將供試材料分為7大類，其中凈果組中的狗棗獼猴桃、梅葉獼猴桃、四萼獼猴桃、大籽獼猴桃、對萼獼猴桃、團葉獼猴桃聚為一類，紫果獼猴桃和白背葉獼猴桃聚為一類，而軟棗獼猴桃、黒蕊獼猴桃、葛棗獼猴桃聚為一類。星毛組中的漓江獼猴桃、大花獼猴桃、井岡山獼猴桃、湖北獼猴桃、江西獼猴桃、繁花獼猴桃、安息香獼猴桃聚為一類，黃毛獼猴桃、小葉獼猴桃、闊葉獼猴桃聚為一類，禿果毛花獼猴桃、白色毛花獼猴桃與毛花獼猴桃聚為一類。斑果組中異色獼猴桃、京梨獼猴桃、毛葉硬齒獼猴桃聚為一類。而凈果組中紫果獼猴桃和白背葉獼猴桃，軟棗獼猴桃、黒蕊獼猴桃和葛棗獼猴桃分別聚類；星毛組中的黃毛獼猴桃、小葉獼猴桃與闊葉獼猴桃，禿果毛花獼猴桃、白色毛花獼猴桃與毛花獼猴桃分別聚為一類，這可能是在異位保育下生態環境改變導致種間或變種間產生分化，本研究結果與傳統的形態分類大體一致。

本研究首次應用新型EST-SSR分子標記技術對獼猴桃種質資源進行遺傳多樣性評價，結果證實EST-SSR標記具有開發簡便及成本低廉等優點， EST-SSR標記對獼猴桃種質資源的多態性評價及遺傳變異分析有效、穩定和可靠，可為獼猴桃分子育種、遺傳改良及功能基因組研究奠定基礎。

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