龍眼水通道蛋白基因(DLPIP1)的克隆與表達(dá)分析

摘 要： 應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究低溫脅迫下龍眼葉片蛋白質(zhì)組變化時(shí)，發(fā)現(xiàn)PIP1 蛋白在龍眼低溫脅迫中上調(diào)表達(dá)。應(yīng)用RACE 技術(shù)克隆龍眼水通道蛋白基因全長cDNA，命名為DLPIP1，基因登陸號(hào)為JN572691，長度為1 132 bp，包括1個(gè)900 bp的開放閱讀框，編碼299 個(gè)氨基酸序列，同源性分析表明，DLPIP1 在21 個(gè)不同植物中的一致性為90%~93%。應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對(duì)DLPIP1 氨基酸序列分析表明，含有7 個(gè)跨膜區(qū)，有2 個(gè)NPA 單元，其氨基酸殘基與MIP 家族蛋白保守區(qū)序列完全一致。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該序列與其他物種PIP 質(zhì)膜水通道蛋白氨基酸序列有很高的同源性。利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對(duì)DLPIP1 在低溫脅迫下不同組織表達(dá)譜分析表明， DLPIP1 在龍眼根、莖、葉中都有表達(dá)，在根中的表達(dá)量最高，其次是莖和葉。DLPIP1 在低溫脅迫時(shí)，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長而發(fā)生變化。這說明DLPIP1 蛋白在龍眼低溫逆境過程中起作用。

關(guān)鍵詞：龍眼； 水通道蛋白； 低溫脅迫； 克隆； 表達(dá)

中圖分類號(hào)：Ｓ６６7．2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：Ａ 文章編號(hào)：１００９－９９８０（２０12）０2－0225－０6

Cloning and expression of longan aquaporin （DLPIP1）gene

CHEN Hu1， HE Xin-hua1，2*， LUO Cong1， DENG Li-bao1， HU Ying1， LI Ming-juan1， YANG Li-tao1，3

（1College of Agriculture， Guangxi University， Nanning，Guangxi 530004 China； 2Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Lab， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning，Guangxi 530007 China； 3State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources， Guangxi University， Nanning，Guangxi 530004 China）

Abstract: The protein expressions under low temperature stress were studied using proteomics method．The results showed that the expression of DLPIP1 protein was up-regulated. The full length of DLPIP1 cDNA obtained by RT-PCR was 1 132 bp with a 900 bp open read frame which encoded a putative DLPIP1 protein with 299 amino acids. Comparison of the amino acid sequence homology among DLPIP1 proteins from 21 different species indicated that DLPIP1 protein had a range of 90% to 93% identity with homologues of other plants. Bioinformatics analysis demonstrated that DLPIP1 exhibited a typical structure with seven membrane-spanning domains and an internal symmetry showing two highly conserved NPA motifs and possessing the MIP family signal consensus sequence. The DLPIP1 amino acids showed high identity with the PIP plasmalemma subfamily of other 21 plant species by homology comparison analysis. Quantitative real-time PCR results showed that the DLPIP1 expressed in root， stem and leaf， while the amount of expressions were different in different organs. The mRNA of DLPIP1 was the most abundant in root， the least in leaf and stem. Furthermore， the mRNA of DLPIP1 changed with time extension under low temperature stress. These results suggested that DLPIP1 might be involved in function of chilling stress.

Key words: Longan； Aquaporins； Chilling stress； Clone； Expression

水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）是細(xì)胞膜上專一、高效的水?dāng)U散特異孔道蛋白，它提供了細(xì)胞的水分跨膜雙向運(yùn)輸通道，是水進(jìn)出細(xì)胞最主要的途徑，在各種逆境脅迫下，水分調(diào)節(jié)過程中起重要作用[1]。深入了解植物水通道蛋白在的水分吸收、運(yùn)輸、利用等方面的機(jī)制，對(duì)培育抗逆植物有著重要的意義。目前，已從多種植物中克隆得到水通道蛋白，并發(fā)現(xiàn)水通道蛋白是個(gè)家族基因，如在擬南芥中得到35 種AQP 基因[2]，玉米中得到35 個(gè)[3]，水稻中得到33 個(gè)[4]，冰花中得到14 個(gè)[5]等。

目前已有大量文獻(xiàn)研究了水通道蛋白與各種逆境脅迫之間的應(yīng)答關(guān)系[1]，但有關(guān)果樹AQP 的克隆和響應(yīng)低溫脅迫機(jī)制的研究還較少，未見有關(guān)龍眼水通道蛋白研究的報(bào)道。為此，本研究從蛋白水平出發(fā)，應(yīng)用RT-PCR 和RACE 技術(shù)克隆水通道蛋白基因全長，通過相關(guān)軟件分析該基因序列特征及相關(guān)結(jié)構(gòu)域。利用熒光定量技術(shù)研究該基因在低溫脅迫下的表達(dá)模式，為深入了解其在逆境脅迫中的功能和龍眼抗寒分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料及試劑

以盆栽1 a生龍眼品種石硤為材料，將長勢一致的幼苗搬入人工調(diào)控室（溫度為25 ℃，白/晝?yōu)?6/8 h，相對(duì)濕度65%）適應(yīng)一段時(shí)間后將苗放入4 ℃低溫處理室內(nèi)分別在處理0（CK）、2、4、8、12、24、48、72 h，將采好樣品立即保存于－80 ℃冰箱備用。

大腸桿菌DH5α、pMD18-T 克隆試劑盒、dNTP、Taq DNA 聚合酶、凝膠回收試劑盒購自Bioer 公司；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶購自TaKaRa 寶生物工程有限公司（中國大連）公司，Real time-PCR 試劑盒購自天根公司，所用引物合成及測序由上海生工完成，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 雙向電泳及凝膠分析

低溫脅迫龍眼葉片（4 ℃低溫處理0 h為對(duì)照，24 h為處理）蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，總蛋白提取、雙向凝膠電泳、圖像分析及差異蛋白的分析及鑒定參考Yang等[6]和游向榮[7]的方法。

1.3 總RNA 提取及cDNA 合成

利用SDS 法提取龍眼葉片總RNA，將提取的各處理RNA 濃度稀釋至同一濃度。cDNA 合成用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄引物為Oligo（dT）18：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC（T）18-3'，具體步驟按說明書進(jìn)行，完成后取4 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢查并用紫外分光光度計(jì)檢測濃度后，再將不同處理cDNA 稀釋到同一濃度。

1.4 DLPIP1 基因的克隆

以MALDI-TOF-TOF/MS 分析鑒定的PIP1 蛋白氨基酸序列運(yùn)用BLAST 程序在GenBank 進(jìn)行搜索，選取同源性較高植物的核酸序列，利用DNAMAN 軟件設(shè)計(jì)基因上游兼并引物 PIP1F：5'-GC（A/G）AGGAAGCTGTG（C/G）（C/T）AC-3'，下游引物為逆轉(zhuǎn)錄加尾引物 3side：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'。然后根據(jù)已得到的基因3' 端，利用羅聰?shù)萚8]方法設(shè)計(jì)特異引物PIP1R1：5'-AGTGGACCAAGAACACTGCGAAGCC-3'；PIP1R2: 5'-CTCAG CACCAAGA CCATCACCCTTG-3' 獲得基因5'端。

擴(kuò)增PIP1基因的PCR體系為25 μL，模板為不同處理cDNA 等體積的混合樣，具體操作按照說明書進(jìn)行。PCR擴(kuò)增參數(shù)為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s；58 ℃ 1 min；72 ℃ 2 min；35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，回收純化目的條帶，連接到pMD18-T載體，熱激轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α，通過藍(lán)白斑篩選挑取白色菌落，經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證為陽性克隆子后送上海生工測序，測序正確后拼接基因全長。并在基因ORF兩端設(shè)計(jì)引物PIP1F1: 5'-ATGGAAGGTAAGGAAGAGGATGTGA-3'；PIP1R3: 5'-TTAGGCCCTGGCCTTGAATGGAATG-3'，擴(kuò)增、克隆、測序進(jìn)行驗(yàn)證。

1.5 DLPIP1基因生物信息學(xué)分析

用BioXM2.6預(yù)測該基因氨基酸序列；將龍眼DLPIP1基因核酸及其蛋白氨基酸序列提交NCBI，檢索DLPIP1基因與其他物種的同源性；利用Clustalx軟件構(gòu)建DLPIP1基因氨基酸序列進(jìn)化樹；在線網(wǎng)站（http://isoelectric.ovh.org/）計(jì)算該基因氨基酸的等電點(diǎn)和蛋白質(zhì)分子質(zhì)量；用WoLF PSORT在線軟件對(duì)基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位；用SOSUI signal軟件預(yù)測基因的信號(hào)肽；用ExPASy Proteomics Server軟件分析基因的親水性和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測；用SOPMA軟件預(yù)測基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)；用SMART和Motif Scan 軟件對(duì)DLPIP1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。

1.6 DLPIP1表達(dá)的 Real time-PCR 分析

為了探明龍眼DLPIP1 基因在低溫脅迫過程中時(shí)空表達(dá)的變化，以不同低溫處理時(shí)間材料的cDNA 為模板，以龍眼β-actin 基因（EU340557.1）作為內(nèi)參，采用 Real time-PCR 技術(shù)對(duì)DLPIP1 在低溫脅迫下不同時(shí)間和不同組織（根、莖、葉）下的表達(dá)模式進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)內(nèi)參引物β-actinF:5'-CTGATGGACA GGTTATCACTATTGGT-3'， β-actinR: 5'-CAATCATGGATGGC TGGAAGA-3'；根據(jù)獲得的DLPIP1 基因全長序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異性引物DLPIP1QF:5'-AGAGACTCCCATGTCCCTATTTTG -3'，DLPIP1QR:5'-GGCCAAGTGGACCA AGAACA-3'；反應(yīng)在ABI7300熒光定量PCR儀上進(jìn)行， 反應(yīng)體系為20 μL， 具體方法參照天根公司熒光定量試劑盒Real Master Mix（SYBR Green Ⅰ）說明書。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s；55 ℃ 45 s；72 ℃ 20 s；40個(gè)循環(huán)。按照 2-ΔΔCT法[9]計(jì)算出基因轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫龍眼差異蛋白質(zhì)雙向電泳分析

本實(shí)驗(yàn)以龍眼為材料，采用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)對(duì)龍眼葉片低溫脅迫蛋白質(zhì)進(jìn)行IEF-SDS-PAGE分離，利用PDQuest 軟件對(duì)2-D 凝膠圖進(jìn)行分析，共有45 個(gè)蛋白點(diǎn)被鑒定為相應(yīng)低溫脅迫蛋白，并質(zhì)譜鑒定出30 多個(gè)差異蛋白點(diǎn)，其中，質(zhì)譜鑒定蛋白點(diǎn)30（PIP1 蛋白）在低溫脅迫下表現(xiàn)上調(diào)（圖1），說明PIP1 表達(dá)與低溫逆境之間存在一定關(guān)系。

2.2 DLPIP1 基因全長cDNA 的獲得

為進(jìn)一步研究PIP1 基因與低溫脅迫的關(guān)系，以龍眼品種“石硤”幼苗不同低溫（4 ℃）處理時(shí)間的混合RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄引物為Oligo （dT）18 合成cNDA，再以cDNA 為模板，用兼并引物PIP1F 和3side 和特異引物PIP1R1，PIP1R2分別進(jìn)行3′RACE 和5′RACE 擴(kuò)增，分別得到超過500 bp（圖2-A）和超過800 bp（圖2-B）片段，經(jīng)過回收、克隆、測序、拼接得到基因全長。為驗(yàn)證拼接結(jié)果的正確性，設(shè)計(jì)ORF 引物PIP1F1 和PIP1R3，并將PIP1F1 和3side 引物擴(kuò)增基因全長，結(jié)果分別得到長約900 bp（圖2-C）和1 200 bp（圖2-D）的條帶，對(duì)目的條帶回收，連接轉(zhuǎn)化，藍(lán)白篩選后送上海生工公司測序，拼接后得到1 132 bp 的序列，與拼接結(jié)果完全一致。BioXM2.6 分析顯示包含啟始密碼ATG 和終止密碼TAA，為PIP1 基因全長序列。該基因命名為DLPIP1，基因登錄號(hào)為JN572691。DLPIP1 的cDNA 包含一個(gè)900 bp（1~900 bp）的完整開放閱讀框，編碼299 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，還包含232 bp的3' 非編碼區(qū)，在這區(qū)域有個(gè)22 bp ployA 尾巴（圖3）。

2.3 DLPIP1 基因生物信息學(xué)分析

用在線軟件（http://isoelectric.ovh.org/）預(yù)測DLPIP1 基因所編碼的氨基酸序列的等電點(diǎn)為8.8，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為31.9 ku；DLPIP1 的亞細(xì)胞定位在質(zhì)膜； DLPIP1 信號(hào)肽分析顯示該蛋白不含信號(hào)肽，是一類膜蛋白，有7個(gè)跨膜區(qū)域；用ExPASy Proteomics Server 預(yù)測DLPIP1 疏水性最大值為2.667，最小值為-2.789；NetPhos 2.0 Server軟件分析顯示該蛋白有8 個(gè)Ser、2 個(gè)Thr和1 個(gè)Tyr 磷酸化位點(diǎn)；利用SOPMA 軟件完整的預(yù)測DLPIP1 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有122 個(gè)α-螺旋占34.11%，隨機(jī)卷曲128 個(gè)占42.81%，延伸鏈60 個(gè)占20.07%，β-轉(zhuǎn)角9 個(gè)只占3.01 %，用SMART 和Motif Scan 軟件對(duì)DLPIP1 的蛋白功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果顯示: 51-293 aa 為水通道蛋白保守區(qū)域，44~124 和125~286 aa 之間為 MIP 家族結(jié)構(gòu)域，有2 個(gè)NPA單元，另外該基因具有MIP 基因家族序列的信號(hào)序列XINPAVTFG，說明龍眼DLPIP1 蛋白應(yīng)屬于質(zhì)膜水通道蛋白家族。該蛋白存在1 個(gè)cAMP 和cGMP 依賴蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)RKLS，2 個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)TKGD 和SATD，2 個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)SER 和TLK， 1 個(gè)C -末端定位信號(hào)ARA，10 個(gè)N-肉豆蔻酰化位點(diǎn)GVSKSN、GIAWAF、GMIFAL、GISGGH、GLLLAI、GLLLAR、GAICGA、GVVKGF、GINPAR和IGAALA。

2.4 DLPIP1基因同源序列分析

利用NCBI Blast 分別檢索與龍眼DLPIP1 的核苷酸和氨基酸同源的其他物種序列，發(fā)現(xiàn)該基因與其他物種核苷酸序列同源性在76%~83%，其中與橡膠樹（Hevea brasiliensis，GQ479823.1），葡萄（Vitis，DQ834696.1）；白楊（Populus，XM-002303560.1）陸地棉（Gossypium hirsutum，DQ402075.1）的同源性為83%、82%、82%、81%，氨基酸序列同源性分別為93%、92%、92%、93%，并與其他PIP1類型質(zhì)膜蛋白序列同源性在90%以上，在水通道蛋白功能區(qū)域的氨基酸序列都高度保守。

用Clustalx 軟件構(gòu)建DLPIP1 與其他物種的氨基酸序列進(jìn)化樹（圖4）。22 個(gè)不同物種PIP1 類型質(zhì)膜水通道蛋白被聚為7 個(gè)類群，DLPIP1 與其他7 個(gè)物種聚為一大類，其中與橡膠樹，陸地棉，蓖麻聚為一小類，親緣關(guān)系近。另外草莓和香石竹聚為一類，禾本科的甘蔗和水稻聚為一類，薔薇科的蘋果和西洋梨親緣關(guān)系近，聚為一類。而楊柳科的白楊單獨(dú)歸為一類。龍眼DLPIP1 蛋白基因與21 個(gè)物種質(zhì)膜類水通道蛋白氨基酸序列聚類分析表明，龍眼水通道蛋白DLPIP1 與質(zhì)膜類水通道蛋白基酸同源性均達(dá)到90% 以上，因此龍眼DLPIP1 蛋白應(yīng)屬于質(zhì)膜水通道蛋白家族。

2.5 DLPIP1 基因的表達(dá)分析

我們又從mRNA 水平上對(duì)轉(zhuǎn)錄特性進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DLPIP1 在不同組織中均有表達(dá)（圖5），為組成型表達(dá)。在整個(gè)低溫脅迫過程中DLPIP1 在根中的表達(dá)量最高，莖和葉中的表達(dá)量較低，除根在處理2 h 表達(dá)量出現(xiàn)先降趨勢，總體上DLPIP1 在低溫處理過程中出現(xiàn)先下降后升高趨勢。不同組織均在低溫處理 8 h 時(shí)達(dá)到峰值，根、莖、葉DLPIP1 的表達(dá)量分別為對(duì)照的 0.78倍、3.4 倍和4.5 倍。在處理 24 h后葉中表達(dá)量出現(xiàn)小幅度上升，而莖中表達(dá)量則降到最低值僅為對(duì)照的0.31倍，在根中變化不大。表明DLPIP1 受到了低溫脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)與低溫脅迫有一定的關(guān)系。

3 討 論

AQP 廣泛存在于各種植物中，AQP 具有水分運(yùn)輸、細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外水的平衡、調(diào)節(jié)細(xì)胞的脹縮、滲透脅迫響應(yīng)、氣孔運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)等功能，尤其在植物體內(nèi)的跨膜運(yùn)輸中主要通過水通道蛋白（尤其是原生質(zhì)膜上的水通道蛋白）來實(shí)現(xiàn)[10-12]。在其諸多生理功能中水孔蛋白如何參與非生物脅迫（干旱、光、低溫等）的應(yīng)答一直備受科研人員關(guān)注。近年來，AQP參與逆境脅迫（尤其是干旱脅迫）應(yīng)答機(jī)制已有較多報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以龍眼為材料，從蛋白質(zhì)水平研究表明，DLPIP1 蛋白在低溫脅迫下表現(xiàn)上調(diào)，說明DLPIP1 基因與低溫逆境之間存在一定關(guān)系。為進(jìn)一步研究DLPIP1 基因與低溫脅迫的關(guān)系，克隆了龍眼DLPIP1 基因全長，經(jīng)過與其他物種的序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因與其他物種的PIP1 質(zhì)膜蛋白類型同源性很高，并在水通道蛋白功能區(qū)域的氨基酸序列高度保守。對(duì)龍眼DLPIP1 基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)多個(gè)不同類型的磷酸化位點(diǎn)，目前已有報(bào)道證明在脅迫下這些磷酸化位點(diǎn)被依賴于Ca2+的蛋白激酶所磷酸化，并且磷酸化水平與基因的水通道活性有關(guān)[13]。Johansson等[14]對(duì)水通道蛋白如何通過磷酸化調(diào)節(jié)水分運(yùn)輸提出了假說。另外糖基化（Glycosylation）作用也可能調(diào)控植物AQPs 的活性，但在DLPIP1 中并沒用發(fā)現(xiàn)糖基化位點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)從mRNA 水平上對(duì)轉(zhuǎn)錄特性分析表明DLPIP1 基因在轉(zhuǎn)錄水平上受到了低溫脅迫的誘導(dǎo)，并且長時(shí)間低溫脅迫，促使DLPIP1 基因表達(dá)量下降，可能是由于蛋白活性受到抑制，降低水通道蛋白通道活性，使植物體內(nèi)水分流動(dòng)受阻，減少水分流失，從而增強(qiáng)植物抵抗低溫的能力[1，15]。這與Arocaa 等[16]研究玉米水孔蛋白在低溫脅迫30 h以后才參與玉米的抗冷反應(yīng)及大多數(shù)研究結(jié)果相一致。但不同組織的表達(dá)量存在差異，這與基因在植物體內(nèi)的分布和行使的功能有關(guān)。另外，在低溫脅迫24 h時(shí) DLPIP1表達(dá)量這與前期蛋白水平研究相反，可能是在低溫脅迫過程中水通道蛋白有一個(gè)適應(yīng)階段。以上所述說明了水孔蛋白參與了龍眼的抗冷反應(yīng)，下一步實(shí)驗(yàn)將通過原核表達(dá)，抗體制備及轉(zhuǎn)基因等方面的研究，進(jìn)一步探討DLPIP1 基因在龍眼低溫脅迫下的水分運(yùn)輸機(jī)制，為龍眼抗寒機(jī)制研究積累理論資料。

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