香蕉植株內生細菌群落的PCR-DGGE分析

摘要: 以健康香蕉植株和感染香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum f. sp. cubense （FOC）后的香蕉植株的根莖葉組織為材料，提取樣品中的總DNA，擴增細菌的16S rDNA的V3可變區，對擴增產物進行DGGE電泳分析，并對其中18條優勢條帶進行切膠回收、克隆測序和系統發育分析。結果表明，香蕉健株與病株各組織中所含內生細菌的種群豐富度為根部＞假莖＞葉片；感病植株組織內生細菌種類比健康植株豐富；BLAST結果為大部分克隆序列與已知細菌16S rDNA基因序列的同源性較高（94%~100%），分別歸屬于藍細菌門（Cyanobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）、變形桿菌門（Proteobacterium）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和綠菌門（Chlorobi）7大類群；其中一個序列同源性較低（91%），可能代表新的分類單元。

關鍵詞: 香蕉；內生細菌；DGGE；群落結構；多樣性

中圖分類號：Ｓ６６8．1 文獻標志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０（２０12）０2－0235－０6

Analysis of entophytic bacteria community structure in banana by PCR-DGGE technique

LIU Fei-fei，LI Chi*，LIU Yong-qin，YU Li

（College of Agriculture， Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088 China）

Abstract: The total genomic DNA was extracted from various tissues of both the healthy bananas and the ones which were infected with Fusarium oxysporum f. sp. cubense （FOC）. Then the 16Sr DNA V3 fragment polymerase chain reaction products amplified from the total genomic DNA were analyzed by denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE）. The results of sequence analysis of the 18 DGGE dominant bands showed that the population abundance of endophytic bacteria contained in the healthy banana plants and the infected plants was different. The most abundant population was found in roots ，the middle in the bulb tissue and the least in leaves; The abundance of endophytic bacteria increased after infection with FOC; And most of the sequences were phylogenetically close to Cyanobacteria， Chloroflexi， Actinobacteria， Proteobacterium， Bacteroidetes， Firmicutes and Chlorobi； But the homology for one of the sequences was only 91%. It may represent a new taxon.

Key words： Banana； Entophytic bacteria； Denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE）； Community structure； Diversity

植物內生細菌是一類在健康植物棲居，對植物無害并與植物建立和諧關系，廣泛存在于植物根、莖、葉、花、果實和種子等器官中的微生物群落[1]。植物內生細菌具有宿主特異性，同一宿主植物的不同器官、生育期及宿主所處的環境條件的不同，其內生細菌群落結構也不同[2]。目前，內生細菌的研究主要集中在內生細菌的分離鑒定、植物病害的生物防治、對宿主植物的促生作用以及內生細菌種群多樣性研究等領域[3-5]。在研究方法上以傳統的分離培養方法為主，但是由于培養條件的限制，可培養細菌種群數量僅占細菌總數0.1%~10%，90%以上的微生物不能進行人工培養[6]。所以，分離培養技術不能全面、準確反映微生物種群多樣性概況。PCR-DGGE技術是近幾年發展起來的一種技術，在分析微生物群落結構和多樣性的研究中具有檢測極限低，分離快速、簡便、重復性好和同時分析多個樣品的優點。目前PCR-DGGE技術在濕地[7]、污水[8]、海洋[9]等領域微生物多樣性的研究應用比較廣泛，在植物內生微生物多樣性的研究中也有應用[10]。

在香蕉內生細菌多樣性的研究中，國內付業勤等[11]對健康香蕉植株可培養細菌進行了研究，明確了可培養細菌在香蕉植株不同器官中的數量分布，不動桿菌屬（Acinetobacter）等9種內生細菌對香蕉枯萎病菌有抑制作用。潘羨心用16S rDNA序列分析法證明了香蕉根部具有豐富的內生細菌[12]。我們采用非培養方法，利用PCR-DGGE分子生物學技術，研究香蕉內生細菌群落多樣性，揭示香蕉不同器官健株與病株組織內生細菌群落結構的差異，對了解香蕉和開發新的微生物資源具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌種: 2009年從湛江硇洲島采集香蕉枯萎病害標本，經過分離、鑒定，獲得的純化菌株Fusarium oxysporum f. sp. cubense （FOC），菌株編號HMGDOU40928，保存在廣東海洋大學植保科技中心。

供試香蕉苗: 香蕉苗株高30~40 cm，5~6片葉子，品種為巴西蕉。

1.2 主要試劑

DNA marker、DNA Taq 聚合酶、DNA純化試劑盒、pMD18-T載體試劑盒、大腸桿菌DH5感受態細胞，購自TAKARA；PCR引物338F-GC、518R、338F、M13-47和M13-48，由上海生工生物技術有限公司合成。

1.3 香蕉苗接種及表面消毒

香蕉苗進行傷根接種[13]，孢子濃度為106 cfu·mL-1，每個處理香蕉苗30株，以無菌水為空白對照。各處理的香蕉苗，置室溫常規盆栽。40 d后的香蕉苗根莖葉各組織進行表面消毒處理[14]，同時將最后一次沖洗水150 μL涂于LB平板上，28 ℃培養72 h，檢測表面滅菌效果，然后用于提取植株組織總DNA。

1.4 組織總DNA提取與純化

參照沈洪等[15]改良的CTAB法提取香蕉根部、假莖、葉片的總DNA。總DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以Hind III DNA Marker做分子質量DNA，用Gel Red染色后在紫外凝膠成像系統（美國Bio-Rad GelDoc XR+）中觀察，拍照。

1.5 16S r DNA V3區PCR的擴增

以降落式PCR[16]擴增細菌16S rDNA的V3區片段。選擇細菌的16S rDNA的V3區通用引物338F-GC（5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGG GCGGGG GCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’） 和518R（5’-ATTACCGCGGCTG CTGG-3’），提取得到的總DNA適當稀釋后做模板進行PCR。PCR體系: 10×PCR buffer 5 μL，dNTP 4 μL（2.5 mmol·L-1），引物各1 μL（10 μmol·L-1），模板DNA 2 μL，Taq酶 0.5 μL（5 U·μL-1），加雙蒸水至50 μL。PCR反應條件: 94 ℃變性10 min，94 ℃變性1 min，65 ℃（-1 ℃/循環）退火1 min，72 ℃延伸2 min，共10個循環，然后94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共20個循環，最后再72 ℃下延伸10 min。PCR產物用2%的瓊脂糖凝膠進行檢測，后用于DGGE分析。

1.6 各組織的DGGE電泳及圖譜分析

DGGE（南京，DGGE-1102）條件為: 聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，電泳緩沖液為1×TAE，設置凝膠變性梯度為45%~70%[17]，每孔上樣量為20 μL PCR產物與8 μL 10×加樣緩沖液。電泳溫度為60 ℃，A段電泳電壓60V，45 min，B段電泳電壓120V，10 h。銀染后拍照分析。

所得的DGGE圖譜用Bio-Rad QUANTITY ONE 4.3.0軟件處理，對各個組織樣品條帶進行分析。根據各個樣品在DGGE圖譜中的顯示，對其相似性進行聚類分析，來比較各樣品中的細菌落結構和多樣性。

1.7 DGGE條帶克隆測序及系統發育樹的分析

將優勢條帶進行切膠回收，4 ℃無菌水中浸泡過夜。以上清液為模板，引物338F（不帶GC夾子）和518R進行16S rDNA V3區的PCR擴增，擴增產物用純化試劑盒進行純化。純化后的產物與pMD18-T載體16 ℃連接3 h，再用熱激法轉化進大腸桿菌 DH5感受態細胞。在含有X-gal、IPTG和氨芐青霉素的LB培養基上，37 ℃過夜培養，篩選出具有氨芐青霉素抗性的白色菌落轉化子。利用載體通用引物M13-47（5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’）和M13-48（5’-AGCGG ATAACAA TTTCACACAGGA-3’）進行菌落PCR檢測，篩選出陽性菌落后，進行搖菌培養，送到上海博尚生物技術有限公司測序。

序列通過分析比對后去掉載體序列提交到Gen Bank進行blast比對。選出同源性最高的序列作為參照菌株，用軟件Clustal X比對后，用MEGA 5軟件構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 樣品總DNA的提取和16Sr DNA V3區的擴增

采用改良后的CTAB方法提取香蕉組織樣品的總DNA，具有較為完整的細菌基因組DNA。且最后一次淋洗水150 μL涂于LB平板上，28 ℃培養72 h，無菌落生長。選擇細菌的16S rDNA的V3區通用引物338F-GC和518R對純化后的各樣品的總DNA進行PCR擴增，所得到的DNA片段均為單一條帶（圖1），片段大小約為180 bp，說明擴增產物無明顯的非特異性擴增現象。

2.2 DGGE的圖譜及分析

對香蕉植株在感染FOC前后各組織內生細菌的種群多樣性的DGGE圖譜（圖2-I）采用Bio-Rad QUANTITY ONE 4.3.0軟件進行分析，結果見圖2-II。

從DGGE電泳圖譜中可以看出植株各組織中內生細菌種類豐富，且差異性較大。健株的根、莖、葉組織中至少存在22、20和15種不同的內生細菌，病株中至少存在30、27、24種，且感病植株內生菌種類明顯比健康植株豐富。1號、2號等條帶較亮，代表健康植株和發病植株中均存在的優勢菌種。5號為病株根部特有條帶，9號、11號、13號為病株假莖特有條帶，17號為病株葉片特有條帶（圖2-I）。

不同組織樣品間條帶的異同，反映了組織之間細菌群落的相似性和差異性。表1列出了各樣品之間內生細菌相似性結果: 各樣品間的細菌群落相似性系數各不相同；同一植株不同組織相似性系數差異性顯著，根、莖、葉內生細菌群落相似性系數都依次降低，健株分別為66.9%、55.0%、43.6%，病株為70.3%、58.0%、46.2%。健株和病株的同類組織的相似性系數較高，根、莖、葉組織內生菌相似性系數分別為75.5%、78.9%、72.0%。

2.3 優勢條帶的系統發育分析

將DGGE圖譜上比較亮的18個條帶進行回收、克隆、測序，所得序列大小為180 bp左右。通過用BLAST與GenBank數據庫序列比對分析，17個條帶所測序列與數據庫中序列相似性在94%~100%（表2），分別歸屬于藍細菌門（Cyanobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）、變形桿菌門（Proteobacterium）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和綠菌門（Chlorobi） 7大類；另外，4號條帶序列與GenBank登陸號為GQ243083的Proteobacterium關系最為密切，相似率只有91%，推測香蕉內生細菌群落中可能存在新的種群。

從系統發育樹可見，7個序列歸屬于藍細菌門Cyanobacterium，占所測序列的38.9%，相似性在98%~100%。7號條帶為擬桿菌門的新鞘氨醇桿菌屬Novosphingobium sp.，是18個陽性克隆中唯一的可培養細菌。絕大多數為不可培養細菌，占94.4%。由圖2-I分析出，1號和2號比較亮的條帶分別與放線菌屬（Actinomyces sp.）、綠彎菌門（Chloroflexi）同源性較高，2者是健康與發病的香蕉植株都存在的優勢菌群。

3 討 論

在研究植物內生細菌時，為避免表面其他微生物的污染，減少腐生細菌DNA殘留問題[15]，應對材料進行嚴格的表面消毒，盡量取植物的內部組織進行總DNA的提取，同時將最后一次沖洗水進行涂平板檢測表面消毒效果，直到培養至無菌落出現為止，這樣才能保證DGGE電泳產生的條帶能反應出組織內生細菌種群的多樣性。

內生細菌在香蕉根、假莖、葉片中的菌落豐富度和種群數量存在差異。各組織中細菌豐富度為根部>假莖>葉片，呈遞減趨勢，根部內生細菌數量最豐富，與羅明等[18]文獻研究結果一致。這可能與土壤中棲息著豐富的細菌種類并可以進入香蕉根部有關。從DGGE電泳圖譜中可以看到感病植株組織內生菌種類比健康植株豐富，與王愛華等[19]研究結果一致，可能與植株感病后的自身抵抗力降低，細菌容易侵入有關。同一植株根、假莖和葉片內生細菌群落相似性系數依次降低，推測大部分內生細菌群落是由根向莖再向葉擴展分布的，也就是說內生細菌可能是種苗攜帶或者通過根部侵入。

研究表明細菌數量超過群落細菌數量1%才可以通過PCR-DGGE檢測出來[20]，因此系統中的弱勢菌群有可能被漏檢，所以香蕉植株具有豐富的內生細菌資源并可能存在未被認知的新物種。對18條帶進行切膠回收并克隆測序，分別屬于7個細菌類群，其中變形桿菌門（ Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）類群與脹果甘草內生細菌的菌群比較相似[21]。放線菌是一類重要的生防菌類群，曹理想等[22]用傳統分離方法研究香蕉內生放線菌和真菌多樣性，共分離156株內生放線菌，優勢菌株與本研究結果不同，本研究所測序得到的放線菌類中是否存在香蕉枯萎病菌的拮抗放線菌，仍需深入研究。綠彎菌門（Chloroflexi）等幾個類群均為不可培養細菌[23]，香蕉內生細菌研究中還未見報道。在所得香蕉植株內生細菌中，藍細菌門Cyanobacteriu的有關菌占35%，為優勢菌群。研究中發現香蕉植株發病后所出現的特征條帶，分別為5、9、11、13和17號帶，這些特有條帶80%為藍細菌門（Cyanobacteri）的細菌。有報道稱藍細菌與蘇鐵[24]、小葉滿江紅[25]等低等植物形成共生固氮體系，藍細菌與香蕉的相互關系還未見報告。藍細菌門（Cyanobacteri）、變形桿菌門（ Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、綠菌門等不可培養內生細菌的作用及與寄主植物之間的相互關系，還有待進一步研究。

PCR-DGGE方法研究植物內生細菌多樣性，初步揭示香蕉植株感染枯萎病菌前后的內生細菌的種類以及不同組織種類的變化情況。這種PCR-DGGE的方法可用于確定不能進行純培養的內生細菌的種類，與以往分離培養直接形態觀察的方法相比，擴大了人們對內生細菌的研究視野，豐富了內生細菌資源，可以提供更多的內生細菌種群信息。DGGE的方法有助于深入了解病原菌與內生細菌之間在寄主植物中相互作用的關系，從而為植物病害的防治提供新的思路。

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