香蕉果皮2個HSP70基因片段的克隆及其在熱激和冷藏過程中的表達

摘 要: 溫度逆境脅迫可以誘導熱激蛋白的表達，而熱激處理能夠減輕果實冷害。為了探討溫度逆境對香蕉熱激蛋白基因表達的調控、辨析香蕉熱激蛋白基因的表達與果實冷害的關系，采用同源序列法分離了香蕉果皮HSP70基因序列-根據已經報道的HSP70基因的氨基酸保守序列設計引物、以香蕉果皮總 RNA為模板，用RT-PCR方法克隆香蕉的HSP70 cDNA，Northern雜交分析該基因在不同貯藏溫度下的表達特征。結果得到2個序列不同的HSP70基因片段，分別命名為Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2，Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2之間的堿基同源性為86.9%，氨基酸同源性為97.1%。Northern雜交的結果表明，38 ℃短期熱激處理誘導了Ma-HSP70-2基因的表達，低溫冷藏能使2個基因的表達增強。并初步認為Ma-HSP70可能與香蕉果實耐冷性有關。

關鍵詞： 香蕉； HSP70； cDNA克隆； 序列分析； Northern雜交

中圖分類號：Ｓ６６8．1 文獻標志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０（２０12）０2－0241－０5

Cloning and expression analysis of two fragments of HSP70 cDNA in the peel of banana during storage at high and low temperature

HE Li-hong1，2，CHEN Jian-ye2，WANG Hai-lan2，KUANG Jian-fei2，LU Wang-jin2*

（1College of Life Science，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou，Guangdong 510225 China； 2Guangdong Key Lab for Postharvest Science，College of Horticulture，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong 510642 China）

Abstract: Many evidences have indicated that temperature stress can induce heat shock protein expression and heat treatment can alleviate chilling injury of fruits. In the present study， two HSP70 fragments were cloned from banana peel using homology-based method in order to investigate their expressions regulated by temperature stress and the relationship between their expressions and chilling injury. Using PCR degenerate primers designed with reference to the conserved amino acid sequences of known HSP70， total RNA extracted from banana peel was used as templates and HSP70 cDNA fragments were amplified by RT-PCR in order to study their expression characteristics under different environments by Northern hybridization. Two different cDNA fragments， named Ma-HSP70-1 and Ma-HSP70-2， were cloned. The homology between two HSP70 is 86.9% at nucleotide acid sequence level and 97.1% at amino acid sequence level. Using Ma-HSP70-1 and Ma-HSP70-2 as probes， Northern hybridization showed that short-time heat pretreatment（38 ℃）only induced the expression of Ma-HSP70-2 transcripts， However， storage at low temperature enhanced accumulations of 2 HSP70 mRNA. Ma-HSP70 might be related to chilling tolerance of banana fruits．

Key words: Banana； HSP70； cDNA cloning； Sequence； Northern hybridization

生物體在高溫或其他逆境脅迫下形成一組特殊的蛋白—熱激蛋白（heat shock proteins，以下簡稱HSPs），植物HSPs種類很多，根據分子質量大小將HSPs分成：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子質量熱激蛋白smHSP。HSPs具有抗熱性、分子伴侶以及協助異常蛋白降解等以保護細胞免受進一步損傷的功能[1-2]。近十幾年來，人們從植物中分離了很多熱激蛋白基因，如在Genebank中登錄了矮牽牛、水稻、筍瓜、綠豆、蕃茄、煙草、小鹽芥、黃瓜、小麥、菠菜、苜蓿、擬南芥、油菜、豌豆、大豆等植物的熱激蛋白基因。香蕉是我國華南地區的主要水果之一，低溫貯藏能夠延長香蕉果實的貯藏壽命。但是，香蕉果實對低溫很敏感，低于 11 ℃就極易發生冷害。有研究表明，熱處理能夠提高番茄等果實的耐冷性[3]，我們的研究也表明，38 ℃熱處理也能夠提高香蕉果實的耐冷性[4]，但熱激蛋白在香蕉果實耐冷性中的作用怎樣尚缺乏研究。因此，分離、克隆香蕉果實熱激蛋白基因并分析其表達特征，對剖析香蕉果實的熱激蛋白及其基因與果實耐冷性的關系及香蕉貯藏技術改進具有重要的理論意義與應用價值。越來越多的研究表明在植物中存在交叉適應：植物經中度脅迫處理不僅能誘導對這種脅迫的抗性，而且能提高對其他脅迫的忍耐力。如，熱預處理誘導了番茄、杧果、葡萄、鱷梨的抗冷能力[5]；短時間的熱處理（如: 62 ℃，20 s）增強了葡萄柚果皮HSP18-Ⅰ、HSP18-Ⅱ、HSP22和HSP70等基因的表達，并且這些基因在之后的冷藏過程中持續表達，進而提高了對低溫的耐性[6]；38 ℃熱處理誘導了葡萄漿果HSP70的表達，并使果實獲得了對低溫的耐性[5]。我們應用RT-PCR克隆香蕉果實HSP70基因，Northern雜交方法分析熱處理及低溫冷藏期間該基因的表達特征，為今后進一步全面研究各種分子量的熱激蛋白與香蕉果實耐冷性的機理奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的香蕉品種巴西（Musa AAA group，cv.Brazil）購于廣東省番禺香蕉果園，采收時蕉指飽滿度7～8成，在果園落梳后用箱子裝載即時運回實驗室。每梳香蕉分成單個蕉指后，挑選均勻一致的無病、蟲、傷的果實，經500 mg·L-1施保功處理后取出晾干。香蕉果實用聚乙烯薄膜袋包裝后，置于相應恒溫箱（MT-533 incubator， Sanyo， Japan）中貯藏。貯藏條件為：常溫（22 ℃）貯藏，熱處理（38 ℃）及低溫（8 ℃）貯藏，常溫貯藏和熱處理的果實于貯藏的第1天和第2天分別取樣，由于低溫貯藏需稍長時間才有冷害癥狀，故低溫貯藏的果實于第3天取樣。每次取10個香蕉果實，將果皮與果肉分離后用液氮速凍并儲存于-80 ℃備用。

1.2 總RNA的提取

總RNA的提取及分離方法為熱硼酸法，參照Wan等[7]的方法進行。

1.3 引物的設計與合成

按照GeneBank中登錄的已知HSP70基因氨基酸保守序列，設計引物。根據已經克隆出來的HSP70 cDNA片段，再在其3’端設計引物，繼續向3’端延伸HSP70 cDNA片段。引物見表1。由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.4 cDNA克隆與序列分析

以香蕉果皮總RNA作為底物，反轉錄合成單鏈cDNA，以該單鏈cDNA為模板與HSP70基因的簡并引物（HSP70 - Up1與HSP70- Dw1）進行PCR擴增。PCR擴增條件為：94 ℃ 3 min，1個循環，然后進行35個循環（94 ℃ 1 min，61 ℃ 2 min，72 ℃ 2 min），循環完畢后，72 ℃再延伸10 min。RT-PCR產物經1%瓊脂糖電泳后，切下目的片段，經回收純化后與pMD 18-T （TaKaRa，Shiga，Japan）載體連接， 轉化感受態細胞DH5α（TaKaRa，Shiga，Japan）。在LB/ AMP/IPTG/X-Gal平板上篩選陽性克隆，然后隨機挑選經EcoRI/HindⅢ雙酶切（TaKaRa，Shiga，Japan） 確認已插入的質粒作序列分析。測序工作委托上海英駿生物技術有限公司完成，采用ABI377（USA）序列分析儀。

1.5 RNA印跡（轉膜）

取10 μg RNA，采用含甲醛的1.2 %瓊脂糖凝膠上進行變性凝膠電泳（電泳條件：50 V，60 min），電泳結束后，在2×SSC的溶液中于室溫下浸洗2次，每次20 min。采用上行毛細管轉移方法以20×SSC作為轉移緩沖液，將變性RNA從凝膠轉移到尼龍膜上 （ Biodyne B 0.45 μm， PALL），轉移16～20 h后，將尼龍膜于80 ℃烘烤2 h，再經紫外交聯后存放于4 ℃冰箱備用。

1.6 探針制備

對質粒DNA進行堿處理，用PCR DIG probe synthesis kit（Roche Applied Science， Mannheim， Germany）合成帶有DIG標記的DNA探針，Ma-HSP70-1合成探針的上游引物序列為5’-TGAACCCCATCAACACCGTC-3’，下游引物序列為5’-CCTCA AAGATACCCTCCTCG-3’； Ma-HSP70-2合成探針的上游引物序列為5’-ATGAACCCAACCAACACCGT-3’，下游引物序列為5’-GACCATAGGCAATA GCAGCA-3’。探針合成的具體方法參見說明書（Roche Applied Science， Mannheim， Germany）。

1.7 Northern雜交

將結合有RNA的尼龍膜在雜交箱中45 ℃預雜交3 h，預雜交液包含以下成分：50%去離子甲酰胺、5×SSC、7%SDS、2%阻斷劑、50 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）和0.1 % 十二烷基肌氨酸鈉 （w/v）。預雜交完后，倒出預雜交液，加入DIG標記的探針，于45 ℃雜交箱中雜交過夜。雜交完后尼龍膜用2×SSC（含0.1 % SDS）漂洗2次，每次10 min。再用0.1×SSC（含0.1 % SDS）在62 ℃下洗2次，每次30 min，經過抗原抗體結合后的膜用Tween-20洗去未結合的抗體，然后用CDP-StarTM通過化學發光原理檢測雜交信號的強弱。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR產物的擴增

經RT-PCR擴增得到1個與目的片段大小相當的910 bp左右的條帶，與pMD 18-T載體連接后，經EcoR I/HindⅢ雙酶切確認已有片段插入（圖1）。

2.2 序列分析與同源性比較

所測質粒中得到2個序列不同的HSP70基因片段。片段長度均為916個堿基，編碼304個氨基酸，分別命名為Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2（序列未列出），為了克隆Ma-HSP70 cDNA全長序列，分別在Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2片斷中設計特異引物（引物序列見表1的Ma-HSP70-1-Up1和Ma-HSP70-2-Up1），再設計簡并引物（參見表1的HSP70-Dw2），繼續向下游擴增186個氨基酸，共計擴增出1 473個堿基編碼490個氨基酸的Ma-HSP70的序列。這2個片段之間的堿基同源性為86.9%，氨基酸同源性為97.1%（圖2）。

2.3 Ma-HSP70-1、Ma-HSP70-2基因在香蕉果皮常溫、熱激及冷藏貯藏過程中的表達

38 ℃熱激處理1 d對Ma-HSP70-1基因的表達影響不大，38 ℃熱激處理2 d表達信號略微增強；剛采收回來的和在22 ℃常溫貯藏1 d、2 d的香蕉果皮的表達信號強度相當，表明HSP70-1基因是持續表達的，即使沒有高溫誘導它也有表達。8 ℃低溫處理3 d后，Ma-HSP70-2基因的表達大幅度升高，由此可知Ma-HSP70-2基因的表達對低溫敏感（圖3）。

38 ℃熱激處理1 d對Ma-HSP70-2基因的表達影響也不大，38 ℃熱激處理2 d表達信號增強；剛剛采收回來的和在22 ℃常溫貯藏1 d、2 d的香蕉果皮的表達信號強度相當，表明Ma-HSP70-2基因不經逆境脅迫也有表達，但是比Ma-HSP70-1基因的表達弱。8 ℃低溫處理3 d后，Ma-HSP70-2基因的表達大幅度升高，由此可知Ma-HSP70-2基因的表達受高溫、低溫誘導（圖3）。

3 討 論

1962年Ritossa[8]在果蠅幼蟲發現熱激反應，1974年Tissieres等[9]分離得到70 ku和26 ku的熱激蛋白，之后研究逐漸擴展到細菌、酵母、植物、哺乳動物以及人類等，并發現熱激蛋白普遍存在于生物體。熱激蛋白不僅由高溫誘導產生，對細胞產生損傷的各種理化因素也都可以誘導熱激蛋白（如疾病、營養缺乏、紫外線照射、干旱、鹽漬、冷、重金屬和氧化性脅迫）。其中HSP70家族成員廣泛分布于細胞核、細胞質、內質網、線粒體和葉綠體等細胞的各個部分，它們具有高度的保守性，真核生物HSP70和大腸桿菌HSP70的同源性大于65%[10]。本試驗克隆的香蕉果皮2個HSP70基因片段之間的堿基同源性為86.9%，氨基酸同源性為97.1%，進一步證實了HSP70家族的高度保守性。

生物體內的HSPs有些是組成型表達的，在無刺激的細胞中也有明顯表達，或是在細胞周期的特定階段產生，或是在生物體發育的某些階段表達，起著管家基因的作用[11]。本試驗發現38 ℃短期熱激處理誘導了Ma-HSP70-2基因的表達，而對Ma-HSP70-1基因表達的影響不大；Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2基因不經溫度脅迫也有表達，而且Ma-HSP70-1比Ma-HSP70-2基因的表達強。表明雖然Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2基因都呈現組成型表達，但短時間高溫卻能誘導Ma-HSP70-2表達。

研究發現植物中存在交叉適應[5-6]，Collins等[12]認為耐冷和HSPs之間有直接關系。本研究發現8℃冷藏能誘導2個基因的表達大幅度增強，表明Ma-HSP70-1受低溫誘導；Ma-HSP70-2則可以受低溫和高溫同時誘導。而且Ma-HSP70-2基因低溫誘導比高溫誘導表達信號要強。

HSP70是主要的分子伴侶，在細胞內分布廣、含量豐富。正常和脅迫條件下，HSP70有防止新合成蛋白質聚集和參與新合成蛋白質折疊的作用[13]。一些家族成員在有機體遇到環境脅迫時才表達，它們可能參與新合成蛋白質的折疊和水解[14]。我們的研究結果表明38 ℃短期熱激處理誘導了Ma-HSP70-2基因的表達，8 ℃冷藏誘導了Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2基因的表達，HSP70的表達能維持細胞內環境的穩定，保護細胞免受進一步傷害。

4 結 論

研究根據GeneBank中登錄的已知HSP70基因氨基酸保守序列，設計簡并引物。擴增HSP70 基因cDNA，得到2個序列不同的HSP70基因片段。2個HSP70基因片段之間的堿基同源性為86.9%，氨基酸同源性為97.1%。利用HSP70 2個基因作為探針進行了Northern雜交，結果表明38 ℃短期熱激處理誘導了Ma-HSP70-2基因的表達，冷藏能誘導2個基因表達增強。Ma-HSP70在香蕉溫度逆境脅迫中可能起到一定的作用。

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