BTH誘導甜瓜愈傷組織活性氧代謝和抗性酶活性的信號途徑

摘 要: 通過對含有苯并噻二唑（BTH）、咖啡酸（CA）或氯化鈷（CC）等不同MS培養上甜瓜愈傷組織的研究，測定了超氧陰離子（）產生速率、過氧化氫（H2O2）含量及抗性相關酶活性的變化，探討了BTH誘導的甜瓜ROS代謝和抗性酶活性及其相關的信號途徑。結果表明，CA可以消除BTH對甜瓜愈傷組織增加和H2O2積累的誘導作用； CA或CC能夠部分抵消BTH對SOD增強的誘導作用； CC對BTH誘導的POD增強具有抑制效應，CA+CC可完全消除BTH對POD的誘導作用；CA和CC均能促進BTH對PAL增強的誘導作用，且具有協同效應。BTH對甜瓜升高、H2O2積累和CAT降低的誘導主要通過SA途徑實現，對POD的影響主要通過ET途徑實現，對SOD升高的誘導通過SA和ET 2條途徑實現，而對PAL活性的影響通過ET和SA以外的途徑實現。

關鍵詞： 甜瓜； 苯并噻二唑； 咖啡酸； 氯化鈷； 活性氧； 抗病相關酶； 信號途徑

中圖分類號：Ｓ６52 文獻標志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０（２０12）０2－0246－０7

The signal pathway of melon calli ROS metabolism and defensive enzyme activities induced by BTH

WANG Chun-lin1，3， ZHANG Yu-xin2， CHEN Nian-lai1，2*， DAI Chun-yan2， FANG Chun-yuan2， KANG En-xiang2

（1Agronomy College， Gansu Agricultural University， Lanzhou，Gansu 730070 China； 2College of Resources and Environment，Gansu Agricultural University， Lanzhou，Gansu 730070 China； 3Long Dong College，Qingyang，Gansu 745000 China）

Abstract: The melon calli were cultured in dark （25±2) ℃ on MS medium contained 5 mmol·L-1 coffeic acid （CA) and/ or 10 mmol·L-1 CoCl2 （CC)， while benzothiadiazole （BTH） were sprayed on the calli. The production rate of ， content of H2O2 and the activities of SOD，CAT，POD，PPO，PAL were determined. The result showed that CA inhibited the induction of BTH on rate， H2O2 production and CAT decrease. While CC stimulated rate， but had no effect on BTH induced H2O2 production and CAT decrease. Either CA or CC could partially inhibit the increase of SOD activity induced by BTH， and CA+CC completely counterbalanced the effect of BTH on SOD. CC eliminated POD increase induced by BTH， while CA showed no effect on this. Both CA and CC promoted the increase of PAL induced by BTH. These results demonstrate that the induction of BTH on CAT activity， rate and H2O2 production is through SA-dependent pathway， the induction of BTH on POD activity is through ET-dependent pathway， and the effect of BTH on SOD activity is through SA- and ET-dependent pathways， while the induction of BTH on PAL may be via signal transduction other than SA- or ET-dependent pathway.

Key words: Melon； Benzothiadiazole； Coffeic acid； Cobalt chloride； Reactive oxygen species； Defensive enzymes； Signal pathway

通過研究和分析植物抗病信號轉導途徑在誘導機制和抗病機制中的作用，有助于我們利用相關基因并培育具有廣譜、高抗的轉基因植物。活性氧（ROS，Reactive oxygen species）是植物寄主-病原物非親和性互作過程中發生的早期事件之一[1-2]。ROS在植物抗病過程中具有殺菌、引發過敏反應、加強細胞壁、促進植保素合成等作用，還是植物抗病信號轉導中的第二信使[3-4]。靜息細胞內的ROS被控制在很低的范圍，當細胞受到各種生理或病理因素作用時，多種細胞外信號分子作用于膜受體，ROS被受體活化誘導而“有目的”地快速增加，從而作為細胞內信號分子參與細胞增殖，分化和凋亡等各種細胞行為[5]。植物為了將活性氧的量嚴格限制在一定的濃度范圍內，而進化出了一系列復雜的酶促與非酶促降解途徑來清除活性氧，維持活性氧的動態平衡[6]。在植物的保護酶系中，超氧化物歧化酶（SOD）是主要的活性氧清除酶系，它氧化迸發過程產生的歧化為O2和H2O2；POD 不僅是H2O2水解的主要酶之一，而且在特定的條件，也能與NADPH 等反應產生H2O2，生成的H2O2用于細胞壁的木質化或蛋白質的交聯；過氧化氫酶（CAT）使H2O2轉化為H2O和O2[7]。

植物體內至少存在2條主要的抗病信號轉導系統，其中一條依賴于水楊酸（Salicylic acid，SA），介導過敏反應、系統獲得抗性和激活防御基因的表達，并通過與多個細胞因子的相互作用對植株抗性產生廣泛的影響，稱之為SA-依賴性途徑（SA-dependent pathways）；另一條依賴于茉莉酸/乙烯（Ethylene，ET），介導系統誘導抗性，稱為SA-非依賴性途徑[8]。植物體內的SA是通過苯丙烷途徑合成的，肉桂酸-4-羥化酶是其中SA合成的關鍵酶[9]。咖啡酸（caffeic acid，CA）可以抑制SA合成途徑中的肉桂酸-4-羥化酶，進而降低SA含量[10]。ET合成酶是ET生物合成途徑中最后一個酶，催化1-氨基環丙烷-1-羧酸向乙烯的轉化，是組織培養過程中ET合成的限速酶，Co2+能強烈抑制其活性[11]。苯并噻二唑（Benzothiadiazole，BTH）是人工合成的植物誘抗劑，能夠誘導許多重要的農作物產生對病原菌廣譜和持久的抗性[12]。BTH可誘導甜瓜幼苗對白粉病的抗性[13-14]和抗性相關酶活性增強[15]。但關于BTH誘導ROS代謝和抗性相關酶活性增強的信號途徑幾乎沒有報道。我們用BTH處理培養在含SA或/和ET合成抑制劑（CA或/和CoCl2）的MS培養基上的甜瓜愈傷組織，通過監測愈傷組織ROS及相關酶活性變化，探討BTH誘導甜瓜抗病性產生的信號途徑，以期進一步闡釋BTH誘導植物抗病性的生化機理，為植物誘導抗性的應用和抗病機制研究提供更多理論依據，促進誘導抗病性技術在實踐中的應用。

1 材料和方法

1.1 材料和處理

供試甜瓜品種為Tam Dew和卡拉克賽。Tam Dew是白蘭瓜品種，高抗白粉病；卡拉克賽又名伽師瓜，是我國著名哈密瓜品種，易感白粉病[16]。

選取子粒飽滿的甜瓜種子去殼，在75%的醫用酒精中浸泡30 s、再在0.1%升汞中浸泡并搖晃6 min，用無菌水沖洗5~6次后播種在1/2 MS培養基上，置于（25±2） ℃的光照培養箱中發芽。取幼嫩子葉轉接到1/2MS +2.4-D（0.1 mg·L-1）+6-BA （1.0 mg·L-1）的培養基上誘導愈傷組織。選擇長勢良好的愈傷組織，分別作以下處理，處理1：將愈傷組織轉接到含5 mmol·L-1的SA合成抑制劑咖啡酸的1/2 MS培養基上；處理2：將愈傷組織轉移到含10 mmol·L-1 的ET合成抑制劑CoCl2（CC）的1/2 MS培養基上；處理3：將愈傷組織轉移到含5 mmol·L-1 咖啡酸 + 10 mmol·L-1 CoCl2的1/2 MS培養基上；處理4：將愈傷組織轉接到不含咖啡酸或CoCl2的1/2 MS培養基上。用1 mL注射器給上述愈傷組織噴灑BTH（50 mg·L-1）溶液（約1 mL·15 g FW），以無菌水噴灑處理4愈傷組織為對照，在（25±2） ℃下暗培養。于處理后0、2、4、6、8 d取培養瓶中的愈傷組織進行ROS和酶活性測定。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 產生速率 參照宗會等[17]的方法測定，取甜瓜愈傷組織0.3 g，加入5 mL 10 mmol·L-1的鹽酸羥胺，真空滲入15 min，于30 ℃溫箱中溫育45 min，生成NO2。吸取2 mL樣品溶液，與1 mL 17 mmol·L-1的對氨基苯磺酸和1 mL 7 mmol·L-1 α-萘胺充分反應，10 min后取上清液，在530 nm測其吸光值。

1.2.2 H2O2含量 參照林植芳等[18]的方法測定，取甜瓜愈傷組織0.3 g，按1∶2（w∶v）加入預冷的丙酮提取。取1 mL提取液加0.1mL 20%TiCl4的濃鹽酸液、0.2 mL濃氨水，生成的過氧化物-Ti復合物在3 000 r·min-1離心10 min。沉淀用丙酮懸浮洗滌5次。最后將沉淀溶于3 mL 1 mol·L-1的硫酸中，用在410 nm波長下測定吸光值。

1.2.3 SOD 活性測定 取愈傷組織0.3 g于冰凍研缽中，加3 mL預冷的0.05 mol·L-1 BPS（pH 7.8）在冰浴上研磨成漿，4 ℃，10 000 r·min-1下離心20 min，上清液即為粗酶液。活性測定參照李合生[19]的NBT（氮藍四唑）光化還原法，以抑制NBT光化還原50%的酶量為1個酶活力單位。

1.2.4 POD 活性測定 取愈傷組織0.3 g于冰凍研缽中，加3 mL預冷的0.05 mol·L-1 BPS（pH 6.0）在冰浴上研磨成漿，4 ℃，3 000 r·min-1離心10 min，上清液即為粗酶液。活性測定參照李合生[19]的愈創木酚法。

1.2.5 PAL活性測定 參照李合生[19]的方法，取愈傷組織0.3 g，加5 mL含5 mmol·L-1 β-巰基乙醇硼酸緩沖液（pH8.8）、0.5 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）在研缽中研磨，于10 000 r·min-1下離心15 min，上清液為酶液粗提液。取上清液1.0 mL，加入1.0 mL 0.02 mol·L-1苯丙氨酸、2.0 mL蒸餾水，總體積為4 mL。置恒溫水浴30 ℃保溫0.5 h，以每小時在290 nm處吸光度變化0.01所需酶量為1個酶活性單位。

1.2.6 CAT活性測定 酶液提取同SOD，活性測定參照鄒琦[20]的紫外吸收法。

1.3 數據分析

利用SPSS 16.0 統計軟件進行單因素方差分析，差異顯著性測驗采用Duncan 法，作圖軟件為Excel。

2 結果與分析

2.1 咖啡酸和CoCl2對BTH誘導的甜瓜愈傷組織ROS代謝的影響

2.1.1 咖啡酸和CoCl2對BTH誘導的甜瓜愈傷組織產生速率的影響 BTH處理后，2個甜瓜品種愈傷組織產生速率均顯著增加，抗病品種Tam Dew的增加幅度大于感病品種卡拉克賽（圖1）。CA+BTH處理后2個品種產生速率與對照相當，表明咖啡酸可以抑制BTH所誘導的甜瓜愈傷組織產生速率的增加。產生速率在CC +BTH和CA+CC+BTH處理中均顯著高于對照和BTH處理，其中CA+CC+BTH處理的愈傷組織中產生速率最高，說明CoCl2能促進BTH對甜瓜愈傷組織產生的誘導作用，且CoCl2能恢復咖啡酸的抑制作用。

2.1.2 咖啡酸和CoCl2對BTH誘導的甜瓜愈傷組織H2O2含量的影響 BTH處理后甜瓜愈傷組織H2O2含量迅速增加（圖2），且顯著（P＜0.05）高于對照。CC+BTH處理后兩品種H2O2積累量與BTH處理基本一致；CA+BTH或CA+CC+BTH處理后2品種H2O2積累量與對照沒有顯著差異。表明咖啡酸可以抑制BTH對甜瓜愈傷組織H2O2積累量增加的誘導作用，CoCl2對BTH誘導的H2O2積累沒有顯著影響，但CoCl2能抵消咖啡酸對BTH作用的抑制效應。

2.2 咖啡酸和CoCl2對BTH誘導甜瓜愈傷組織抗性酶活性的影響

2.2.1 咖啡酸和CoCl2對BTH誘導甜瓜愈傷組織SOD活性的影響 BTH誘導后甜瓜愈傷組織SOD活性顯著（P＜0.05）高于對照（圖3），卡拉克賽的SOD活性峰值比Tam Dew出現的較晚，約為2 d。CA+BTH和CC+BTH處理后2品種甜瓜愈傷組織的SOD活性都高于CK，但低于BTH處理；CA+CC+BTH處理后的SOD活性與CK相當。說明，單獨使用咖啡酸或CoCl2能夠部分抵消BTH對甜瓜愈傷組織SOD活性增強的誘導作用，2者共存時則能有效抑制BTH的誘導作用。

2.2.2 咖啡酸和CoCl2對BTH誘導甜瓜愈傷組織CAT活性的影響 BTH處理顯著降低了甜瓜愈傷組織的CAT活性，處理后6~8 d Tam Dew的CAT活性受到更大的抑制（圖4）。CA+ BTH和CA+CC+BTH處理后CAT活性與CK間無顯著差異； CC+BTH處理后CAT活性與BTH處理相當。表明CoCl2對BTH誘導的甜瓜愈傷組織CAT活性無顯著影響，而咖啡酸可以消除BTH對CAT活性的抑制作用。

2.2.3 咖啡酸和CoCl2對BTH誘導甜瓜愈傷組織POD活性的影響 圖5所示，BTH處理后甜瓜愈傷組織POD活性顯著增強，且抗病品種Tam Dew的POD活性大幅上升。CA+BTH處理的POD活性與BTH處理相當； CC+BTH處理后POD活性呈先下降而后緩慢升高的趨勢，但顯著低于BTH處理，表明CoCl2對BTH誘導的POD活性增強具有抑制效應；CA+CC+BTH處理完全消除了BTH的誘導作用，愈傷組織POD活性與CK相當。

2.2.4 咖啡酸和CoCl2對BTH誘導甜瓜愈傷組織PAL活性的影響 BTH處理能促進甜瓜愈傷組織PAL活性明顯增強，抗病品種Tam Dew的增幅大于感病品種卡拉克賽（圖6）； CA+BTH、CC+BTH和CA+CC+BTH處理的PAL活性均顯著高于BTH處理，CA+CC+BTH處理的PAL活性最高。表明咖啡酸和CoCl2均能促進BTH對甜瓜愈傷組織PAL活性增強的誘導作用。此外，它們可能對PAL活性升高具有直接作用，且咖啡酸和CoCl2在增強PAL活性方面具有協同效應。

2.3 甜瓜愈傷組織ROS代謝與抗病相關酶活性的相關性

對ROS含量變化與抗病相關酶活性的相關分析結果（表1）顯示，2品種甜瓜愈傷組織PAL活性與產生速率和H2O2含量極顯著正相關，SOD活性與H2O2含量極顯著正相關，CAT活性與產生速率顯著負相關，SOD活性與CAT極顯著負相關、而與POD和PAL活性呈極顯著正相關，說明不論基礎抗性高低，甜瓜的ROS清除均與SOD、PAL、CAT活性密切相關。

3 討 論

3.1 BTH誘導甜瓜愈傷組織ROS代謝的信號途徑

BTH處理能夠顯著提高甜瓜愈傷組織產生速率和H2O2含量，抗病品種產生速率和H2O2積累量高于感病品種，與BTH誘導甜瓜葉片抗病性提高的結果相一致[21]；咖啡酸處理抑制了BTH對產生速率和H2O2含量的誘導作用，表明其阻斷了BTH對甜瓜ROS信號途徑的誘導作用；CoCl2處理促進了BTH對產生速率的誘導，而對H2O2含量沒有影響。結果表明，BTH處理誘導甜瓜愈傷組織產生速率和H2O2積累量的增加，不受ET途徑的影響，BTH可能通過SA等途徑影響ROS積累。

3.2 BTH誘導甜瓜愈傷組織抗病相關酶活性的信號途徑

CoCl2對BTH誘導的甜瓜愈傷組織CAT活性影響不顯著，而咖啡酸可以消除BTH對CAT活性的抑制作用，表明BTH對CAT活性的抑制是通過SA途徑實現的。單獨使用咖啡酸或CoCl2只有部分消除BTH對SOD活性增強的誘導作用，而咖啡酸和CoCl2共存幾乎完全消除了BTH的作用，說明BTH能通過SA和ET 2條途徑誘導SOD活性增強；CoCl2對BTH誘導的甜瓜愈傷組織POD活性具有抑制效應，而咖啡酸對BTH的誘導效應無影響，表明BTH對POD活性的誘導主要通過ET途徑實現。CoCl2或咖啡酸及CoCl2+咖啡酸對BTH誘導的PAL活性增強均無抑制作用，表明BTH誘導PAL活性增強不依賴于SA或ET途徑。相反咖啡酸和CoCl2還有可能作為化學逆境因子促進PAL的活性。嚴文文等[11]研究證明，咖啡酸明顯促進茉莉酸甲酯（MJ）對PAL活性誘導而又明顯降低SA含量，咖啡酸可能抑制了SA合成途徑中肉桂酸-4-羥化酶的活性。本試驗結果與嚴文文等[11]研究咖啡酸和CoCl2對茉莉酸甲酯誘導煙草PAL活性的結果一致。BTH對PAL活性的影響可能是通過ET或SA以外的途徑，咖啡酸和CoCl2對PAL活性增強具有協同效應，BTH對PAL活性的誘導途徑尚需進一步研究。

3.3 BTH誘導的甜瓜愈傷組織ROS代謝與抗病相關酶活性的關系

研究指出，ROS快速積累對誘導植株防衛反應非常重要[22]。H2O2代謝主要由SOD、CAT和POD控制，SOD可將歧化為H2O2，而POD和CAT 可降解H2O2。PAL是植物莽草酸代謝途徑的關鍵酶和限速酶，在木質素的積累、植保素和酚類物質的合成中均具有重要作用。在特定的條件，POD能與NADPH 等反應產生H2O2，生成的H2O2能介導木質素合成以及HRGP在細胞壁中的氧化交聯[23]。2品種甜瓜愈傷組織PAL活性與產生速率和H2O2含量極顯著正相關，SOD活性與H2O2含量極顯著正相關，CAT活性與產生速率顯著負相關，而與POD和PAL活性呈極顯著正相關，說明不論基礎抗性高低，甜瓜的ROS清除均與SOD、PAL、CAT活性密切相關。感病品種（卡拉克賽）H2O2積累量與CAT極顯著負相關、而與PAL不相關，抗病品種（Tam Dew）H2O2積累量與PAL極顯著負相關、而與CAT不相關，說明不同抗性甜瓜品種維持ROS平衡的生化機制有差異。

4 結 論

BTH處理對甜瓜產生速率升高、H2O2積累和CAT活性降低的誘導主要通過SA途徑實現，對POD活性的影響主要通過ET途徑實現，對SOD活性升高的誘導通過SA和ET 2條途徑實現，而對PAL活性的影響通過ET和SA以外的途徑實現。

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