利用胚挽救技術創制葡萄多倍體種質的研究

摘 要: 為培育三倍體無核葡萄新品種，以二倍體歐洲葡萄無核品種紅寶石無核、愛莫無核、黎明無核和歐山雜種北醇及四倍體歐美雜種藤稔、黑奧林為親本，進行了紅寶石無核×藤稔、黎明無核×藤稔、愛莫無核×黑奧林、藤稔×北醇、黑奧林×北醇5個組合的雜交，通過胚挽救技術獲得雜種幼苗41株。在此基礎上，利用流式細胞術、染色體計數的方法對所獲得的雜種幼苗進行了早期倍性鑒定，結果表明有10株雜種為三倍體，6株為四倍體，4株為非整倍體，其余21株為二倍體。這將為進一步選育出三倍體無核葡萄新品種和提供新的育種材料奠定基礎。

關鍵詞: 葡萄；多倍體； 胚挽救； 流式細胞術； 染色體計數； 育種

中圖分類號：Ｓ６６3．1 文獻標志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０（２０12）０2－0269－０5

Study on breeding polyploidy grape by embryo rescue techniques

SHI Yan1，2，3，ZHANG Jian-xia1，2，3，WANG Yue-jin1，2，3*，TANG Dong-mei1，2，3，ZHANG Chao-hong1，2，3

（1College of Horticulture，Northwest A F University， Yangling， Shaanxi 712100 China； 2Key Laboratory of Horticultural plant Biology and Germplasm Innovation in Northwest China， Ministry of Agriculture of China，Yangling， Shaanxi 712100 China； 3State Key Laboratory of Crop Stess Biology in Arid Areas， Northwest AF University， Yangling， Shaanxi 712100 China）

Abstract: For the purpose of breeding triploid grape， five cross combinations including Ruby Seedless (Vitis vinifera) × Fujiminori (V. vinifera × V. labrusca)， Dawn Seedless (V. vinifera) × Fujiminor (V. vinifera× V. labrusca)， Emerald Seedless (V. vinifera) × Black Olimpia (V. vinifera × V. labrusca)， Fujiminori × Beichun（V. vinifera × V. amurensis）and Black Olimpia × Beichun were performed and embryo rescue techniques were employed. As a result， 41 hybrid seedlings were obtained. Furthermore， the chromosome ploidy of these hybrids was measured by flow cytometry and chromosome identification. The results showed that the hybrids were made up of 10 triploid plants， 6 tetraploid plants， 4 aneuploid plants and 21 diploid plants. This study will provide a foundation for further breeding triploid varieties and new breeding materials in grape.

Key words: Grape； Polyploid； Embryo rescue； Flow Cytometry； Chromosome identification； Breeding

多倍體育種是培育果樹新品種的重要途徑。多倍體植株通常表現為生長旺盛、枝粗、葉厚、果大、產量高及適應性強等特點，而多倍體產生途徑有自然芽變、人工化學誘變、人工有性雜交、胚乳培養及花藥培養等[1]。葡萄是全球第2大水果，無核葡萄是當前國際消費的重要方向，培育大粒無核葡萄品種一直受到葡萄育種家的重視。三倍體葡萄除具有多倍體植株的諸多優勢外，還具有果實無核或少核的特點，因此三倍體葡萄育種開辟了培育大粒無核葡萄品種的新途徑。二倍體和四倍體何者做母本，對葡萄雜交和胚挽救效果具有重要影響。山下裕之等[2]利用有核葡萄的四倍體和二倍體雜交，經胚珠培養獲得三倍體植株，其中2x×4x組合的胚發育率和成苗率分別為15.6%～22.1%和7.3%～12.5%；4x×2x組合的胚發育率和成苗率分別為72.4%～78.8%和32.2%～42.4%，可見以四倍體做母本明顯優于二倍體做母本。許多研究也認為[3-7]，采用常規二倍體和四倍體品種間雜交，具有很大的雜交障礙，育種效率極低。前人[6-10]報道了采用二倍體與四倍體品種間雜交及胚挽救獲得了雜種后代。但以上研究均未見有對雜種后代進行倍性的檢測報道。我們選用二倍體歐洲無核葡萄品種與四倍體品種、四倍體品種與二倍體歐山雜種北醇共進行了5個組合的雜交，通過胚挽救技術獲得了部分雜種幼苗，以期進一步選育出葡萄多倍體新品種；在此基礎上，結合流式細胞術、染色體計數對所獲雜種后代進行了早期倍性鑒定，旨在建立一套創制葡萄多倍體育種的方法，為今后的多倍體育種提供技術依據。

1 材料和方法

1.1 材料及儀器

試驗于2007-2008年在農業部西北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室和旱區作物逆境生物學國家重點實驗室完成，其中流式細胞術測定在華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室完成。

葡萄雜交在西北農林科技大學葡萄種質資源圃進行。雜交親本選用二倍體歐洲葡萄種子敗育型無核品種紅寶石無核（Ruby Seedless）、愛莫無核（Emerald Seedless）、黎明無核（Dawn Seedless），歐山雜種北醇（V. vinifera × V. amurensis）以及四倍體歐美雜種藤稔（Fujiminori）、黑奧林（Black Olimpia），共5個雜交組合（表1，表2）。

流式細胞儀為德國Pratec公司生產的Ploidy Analyser（PA-1型），照相設備為日本原產OLMPUS-BX51。

1.2 方法

1.2.1 多倍體葡萄胚挽救程序 按常規方法去雄授粉，紅寶石無核×藤稔、黎明無核×藤稔、愛莫無核×黑奧林、藤稔×北醇、黑奧林×北醇分別于授粉后48、42、47、52、55 d采取果穗剝取胚珠進行離體培養。胚挽救程序參照李桂榮等[11]的方法并加以改進，采用B5為胚珠培養的基本培養基，附加0.5 mg·L-1 BA、2.0 mg·L-1 IAA、0.5 mg·L-1 GA3、6%蔗糖、0.6%瓊脂、0.1%活性炭；培養8周后，以WP為胚萌發基本培養基，附加0.1 mg·L-1 IBA、2%蔗糖、0.6%瓊脂、0.1%活性炭；繼續培養10～15 d進行繼代培養，采用1/2MS為成苗基本培養基，附加0.1 mg·L-1 IBA、2%蔗糖、0.6%瓊脂、0.1%活性炭。

1.2.2 流式細胞儀檢測倍性 采用流式細胞術[12]測定供試材料DNA含量，初步鑒定雜種后代的倍性。取少量幼嫩的葉片或愈傷組織放入Pratec公司專制的培養皿中，加入0.5～1.0 mL的DNA提取液HR-A，用刀片切碎后靜置2～5 min后，將樣品通過30 μm的Partec CelltricsTM微孔膜過濾到測試管中，再加入2 mL染色液HR-B，隨即將樣品上樣，DNA的含量分布圖由流式細胞儀自動生成。首先將父母本品種所產生的分析峰在橫軸上的熒光值FL設定，固定參數，再依次對雜種幼苗的熒光值進行測定。每測試1O個材料后，對父母本品種重做1次測試，以防止因為機器發熱等原因造成數據的不穩定。

1.2.3 細胞學染色體計數法檢測倍性 利用染色體計數的方法進一步測定雜種幼苗的倍性。采用低滲去壁火焰干燥法染色體計數[13-14]，并簡化成以下步驟: （1）預處理: 在超凈工作臺上取雜種試管苗的根尖或莖尖后，立即投入飽和的對二氯苯溶液中常溫下處理 2～3 h；（2）固定: 去除處理液，用蒸餾水沖洗數遍后注入新配制的甲醇∶冰乙酸=3∶1的固定液，常溫下處理3 h以上；（3）酶解: 去除固定液，用蒸餾水沖洗干凈，加入 3.5%的纖維素酶和果膠酶 1∶1 的混合酶液，酶液和材料的比例為 30∶1，在 37 ℃恒溫下酶解 20～30 min；（4）染色: 蒸餾水沖洗后在卡寶品紅染色液中染色 30 min 以上；（5）壓片鏡檢觀察，取一小塊材料放在載玻片上，滴上一滴卡寶品紅染色液，用鑷子搗碎后蓋上蓋玻片，然后按壓住一角用木制小棒均勻敲打蓋玻片，至材料分散成霧狀，用吸水紙吸去多余的染色液后，酒精燈上干燥，再用OLMPUS-BX51型顯微數碼攝影系統照相。

2 結果與分析

2.1 胚挽救技術培養獲得的雜種后代及成苗情況

分別以二倍體無核品種和四倍體有核品種為母本進行了不同倍性的葡萄品種雜交，可以看出，以二倍體無核品種為母本的不同雜交組合中，紅寶石無核×藤稔的胚萌發率最高，達23.1%，明顯大于黎明無核×藤稔的胚萌發率3.39%，說明相同的父本，不同母本雜交胚的萌發率差異較大（表1）；此外，黑奧林×北醇的胚萌發率33.3%，明顯大于藤稔×北醇的胚萌發率17.3%，同樣說明不同母本，雜交胚萌發率差異明顯（表2）；而以四倍體作母本的組合，黑奧林×北醇胚萌發率為所有5個組合中最高，明顯大于以種子敗育型無核二倍體品種為母本的組合。總體來看，不同組合的胚萌發率存在明顯差異，說明不同親本基因型對胚萌發率的影響顯著。各組合成苗率除黎明無核×藤稔外均在50%以上，紅寶石無核×藤稔最高，達87.5%（表1，表2）。胚珠培養至成苗過程見圖版-A~D。

2.2 流式細胞儀對雜種后代的分析結果

通過流式細胞術對5個組合的雜種幼苗共41個單株幼嫩的葉片進行測定，分別將各雜交組合父母本產生的分析峰在橫軸上DNA含量熒光值FL設定，固定參數，二倍體品種為50（圖1-A），四倍體品種為100（圖1-B），依次測定各供試材料DNA含量的熒光值，并與各自設定參數進行對比，結果有二倍體、三倍體、四倍體、非整倍體幾種不同的倍性水平（表3，圖1），三倍體10株，分別為6株紅寶石無核×藤稔雜交后代和4株黑奧林×北醇雜交后代；四倍體6株，分別為1株紅寶石無核×藤稔雜交后代、1株黑奧林×北醇雜交后代和4株藤稔×北醇雜交后代；非整倍體4株，分別為1株紅寶石無核×藤稔雜交后代和3株藤稔×北醇雜交后代；其余21株均為二倍體。

2.3 細胞學染色體計數對胚挽救雜種的倍性分析結果

通過簡化的實驗方法，對供試的5個組合所得的雜交后代已通過流式細胞儀測定出的結果，進行進一步莖尖組織染色體鑒定。結果表明，父母本中二倍體材料染色體數目為38條（圖版-E），四倍體材料染色體數目為76條，而雜交后代中存在多種情況，如非整倍體（圖版-F）、三倍體（圖版-G）、四倍體（圖版-H），其鑒定結果基本與流式細胞術的測定結果一致。

3 討 論

多倍體育種，尤其是三倍體育種技術是獲得優良無子品種的有效方法之一，如三倍體西瓜[15]、三倍體柑橘[16]、三倍體香蕉[17]、三倍體甜菜[18]等。在多倍體葡萄育種上，日本已育成三倍體無核葡萄品種尾玲（Yileyi）、戴拉王（King Dela）、蜜無核（Honey Seedless）、甲斐美嶺（Kai Mirei）、夏黑（Summer Black），我國已育成的三倍體無核早紅（Earlyred Seedless），并在生產上開始推廣[3]。多倍體育種最有效的途徑是采用二倍體和四倍體直接雜交，但二倍體和四倍體雜交的最大障礙是親和力差、坐果率低、雜種胚早期敗育或胚乳解體、獲得三倍體雜交種子生活力低，從而很難獲得雜交后代。國內外學者[6-10]采用胚挽救技術，克服了葡萄二倍體與四倍體雜交中獲得三倍體雜種胚早期敗育、育種效率低的障礙，成功的獲得了三倍體雜種，極大地拓寬了葡萄育種的范圍，提高了育種效率，但對所得雜種幼苗進行倍性鑒定的報道較少。

本研究通過二倍體與四倍體葡萄雜交，經胚挽救技術培養獲得部分雜種后代，采用流式細胞術快速全面地進行半定量分析后，再進一步通過染色體計數法加以直觀的驗證，較為系統地對獲得的雜種后代進行了倍性的早期檢測。結果表明，本研究中所用二倍體無核品種紅寶石無核、愛莫無核、黎明無核，以紅寶石無核作母本較好，而以四倍體品種黑奧林作母本比藤稔好，說明不同的雜交組合，胚萌發率存在明顯差異，尤其是相同父本，不同母本的雜交胚萌發率差異較大，這也說明雜交組合母本基因型對胚萌發率有明顯的影響；而與以二倍體為母本的組合相比較，以四倍體為母本的組合胚萌發率較高，這與郭印山等[4]、徐海英等[10]的研究存在差異，這可能是由于本研究中選用的二倍體品種為種子敗育型無核品種，雜交障礙較大；但以四倍體品種為母本獲得的三倍體幼苗的比例比以二倍體為母本的高，這與郭印山等[4]、Yang等[5]的研究結果相一致。此外，本研究采用二倍體無核品種為母本，除選育出三倍體雜種后代外，所獲得的雜種幼苗含有無核基因的比率將大大提高。因此，今后的多倍體育種研究中，除了繼續優化多倍體育種技術體系外，還應注意雜交親本的選擇與選配，以獲得更多的多倍體雜種后代，提高育種效率。（本文圖版見封底）

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