膽石病動物模型研究

摘 要 研究膽石成因和膽石病的防治方法常需制作膽石病動物模型。許多脊椎動物可產生膽石病，但不同種系的動物致石能力不同。運用膽道梗阻感染法、異物核心埋藏法、藥物注射法、植物神經刺激法和喂飼法可成功地制作膽石病的動物模型，其中低蛋白飲食喂飼法是誘發膽色素結石的常用方法。近年來已對膽石模型的定向控制技術引起重視，但進展尚少。膽石模型在研究膽石成因、病理和臨床治療上有一定價值。

關鍵詞 膽石病 動物模型 致石法

中圖分類號：R657.4+2 文獻標識碼：C 文章編號：1006-1533（2012）20-0003-03

Research on the animal model of cholelithiasis

CAI Duan

（Department of General Surgery， Huashan Hospital， Fudan University， Shanghai 200040， China）

ABSTRACT An animal model of cholelithiasis is necessary for the research on gallstone formation and treatment of cholelithiasis. Cholelithiasis can be induced in many vertebrate animals and different strains of animals have different capacity to form cholelithiasis. An animal model of cholelithiasis can be established by many procedures， such as biliary obstruction and infection， foreign body core implantation， drug injection， autonomic nerve stimulation， lithogenic diet and so on. Low-protein diet feeding is used mostly to establish an animal model of pigment stone. Recently， more attention has been paid to the directional control in the formation of animal model of cholelithiasis in spite of less progress. The animal model of cholelithiasis does have a role in the study of gallstone formation， pathogenesis and clinical treatment of cholelithiasis.

KEY WORDS cholelithiasis； animal model； lithogenic procedure

研究膽石成因和膽石病的防治方法常需制作膽石病動物模型。我們曾為了探討利膽沖劑和膽寧片的作用和機制，用低蛋白Ⅱ號飼料在豚鼠中誘發了膽色素類結石，用高膽鹽-膽固醇飲食誘導制作了小鼠膽固醇膽石病模型，茲將文獻中與此有關的問題作一簡要復習。

1 致石動物模型的要求

已知至少有30多種脊椎動物會產生膽石病。其中牛、馬、豬、狗、豚鼠和大鼠較易產生膽色素結石，而狒狒、倉鼠、小鼠和草原犬鼠較多會產生膽固醇類結石，有些動物還會產生人類所不具有的特種結石。如大鼠中的甘氨石膽酸結石和兔中的甘氨異脫氧膽酸結石，這與動物的不同種系有關。各種動物的膽石發生率很不一致，例如牛為0.68%，馬為0.09%，豬為0.24%，狗為0.02%～0.04%，狒狒為0.01%～0.93%，禽類（如靈鳥）和野生動物（如虎、象等）結石較少，而河貍及蜥蜴的膽石更屬罕見。近年來發現黑熊也會產生膽石，在特定的條件下，其結石的發生率較高。

理想的膽石動物模型應該具有下列條件① 接近人類膽石病；② 動物來源廣，易于飼養；③ 致石方法簡便，致石率高。但至今還沒有一種動物能完全達到上述要求，常用的動物仍為倉鼠、豚鼠、兔、狗等，也有用狒狒進行實驗的。Nakayama認為豬的胃腸道、飲食和膽汁成分均與人類接近，因此非常適用于作為致石實驗的對象。我們為了制作符合我國特點的膽色素結石模型，故選用較易產生膽色素結石的豚鼠作為實驗對象。

2 致石方法

致石方法大致分為下列5種。

2.1 膽道梗阻感染法

用手術造成膽道不同部位的梗阻和感染，易誘發結石，如久次在狗中造成肝內膽管狹窄，Chow和鈴木在大鼠中用結扎法和結扎后注射細菌造成膽總管狹窄和感染，Imamoglu在狗、兔和猴中造成膽總管下端狹窄，Palmer介紹結扎狗、兔、猴的膽囊管，結果都誘發了結石。此法的優點是成石快、致石部位肯定，誘發的結石比較一致，大多為膽色素結石，但方法比較復雜，與人類實際致石情況也有一定距離。

2.2 異物核心法

在動物膽道內埋入無菌性異物，作為膽石核心以誘發結石，如Sato在狗膽道內埋入蛔蟲，王訓穎等在兔膽囊內植入肝組織、線結、人結石和蛔蟲等，結果誘發了結石，此法對研究異物核心的致石作用有一定意義。

2.3 藥物注射法

用某些藥物或毒素對動物進行皮下靜脈或膽囊內直接注射，也可誘發結石。例如皮下注射膽固醇誘發兔和豚鼠的膽固醇結石，靜脈注射克雷伯氏肺炎桿菌的莢膜多糖或皮下注射林可霉素（60 mg/d）誘發豚鼠膽色素結石，皮下注射Vitamin D誘發兔的含鈣結石，以及直接的膽囊內注射藥用炭使狗和豚鼠致石均可歸入此類。注射法的優點在于致石迅速、用藥劑量可靠。但須注意，用藥劑量較大與人體成石情況差距較大。

2.4 植物神經刺激法

刺激動物迷走神經或內臟神經，通過改變膽道運動功力和膽汁成分而促發膽石形成。例如Caicaodeonciae刺激狗迷走神經引起的膽囊內色素沉淀，Shull切斷狗迷走神經，并用滑石粉刺激右側內臟神經，使半數動物產生結石，Shein也有類似報道。這種方法對研究神經紊亂對致石的作用有一定價值。

2.5 喂飼法

用特殊的“致石飲食”可誘發許多動物產生結石，此法簡單易行，并可避免手術和注射的器械損害，致石效果也較肯定，因此使用較廣泛。根據“致石飲食”的特點又可分為“低營養致石法”和“加藥致石法”兩類。

2.5.1 低營養致石法

主要包括“低脂”、“低蛋白”和“低維生素”3種食譜。

（1）低脂致石 最著名的是Dam等配制的“284”號倉鼠致石飼料，其中含20.00%酪蛋白、74.30%蔗糖及足量的維生素和鹽類，但不含任何脂肪和膽固醇，用這種食譜飼養倉鼠在3個月內可使82.00%（50.00%～90.00%）的倉鼠產生膽固醇結石。在此基礎上Dam和Rolin等又配制了低脂含糖食譜，無必需脂肪酸的致石食譜（EFAD）等。

（2）低蛋白飲食 最常用于動物致石實驗，Borgman、Palmer、Zaki、鈴木、佐藤和長瀨正夫等在兔、狗和大鼠中誘發了結石，所用蛋白質約為正常動物飼料中的一半量，平均占食譜的10.00%左右（6.00%～20.00%）。單一低蛋白飲食的膽石致石率不高，誘石周期也較長。為了克服這一弱點，Zaki等在大鼠食譜中加入了石膽酸，結果致石作用明顯增強。作者推測可能是石膽酸影響了肝功能，使膽酸代謝產物升高，與膽紅素共同沉淀的緣故。低蛋白飲食誘發的結石中含有較多的膽色素，其機制尚不明確，可能為①減少膽汁中葡萄糖醛酸（GA）含量，升高膽汁β-G酶活力，增加了膽汁非結合膽紅素（UCB）濃度；②降低組織的抗損傷能力，增加了膽道感染的發生率；③改變膽汁中牛璜氨酸和甘氨酸的比例，降低了膽汁中Zeta的電位；④改變膽汁中粘蛋白性質。低蛋白飲食符合我國和日本的飲食習慣，鈴木等認為這是日本多發色素結石的原因之一。為了接近我國飲食習慣并誘發色素結石，我們在致石實驗中選用了低蛋白飼料喂養豚鼠，結果成功地誘發了色素結石。

（3）低維生素 缺乏維生素A、D的飲食已在兔、大鼠、豚鼠、狗和田鼠中造成結石，其成石機制尚不明確，結石發生率也不高，膽石成分與人類結石相差較大，故近年來已很少應用。

2.5.2 加藥致石法

（1）高膽固醇致石 主要應用于草原犬鼠致石模型。Brennemen、DenBeaten、Hutton、Roslyn等所用的致石飼料中分別含有膽固醇1.20%～2.40%，在一個月內使100.00%的動物產生了膽固醇結石。此外在猴子和倉鼠中亦曾用此法致石。

（2）膽固醇-膽鹽致石劑（C-CA） Teppenman等首先應用C-CA在小鼠中致石，并且證明膽固醇和膽鹽的合并存在是致石的必要條件。常用劑量為膽固醇1.00%，膽鹽0.50%。Bengman、Pedrcin、Culdwell等多次重復了上述結果，并且證實了C-CA致石的機制是干擾動物的膽固醇代謝、使膽汁膽固醇增加、超出了BS—PL的溶解能力、升高了膽汁LI。Frey用無菌小鼠（裸鼠）實驗，證明C-CA致石與細菌感染無直接關系，但感染存在可增加結石發生率。

C-CA致石率較高，效果肯定，一般在一個月內可使60.00%的小鼠致石，但結石較小，需用吸水實驗才能明確。我們為了提高低蛋白飼料在豚鼠中的致石率，在飼料中加了C-CA，以干擾豚鼠的膽固醇代謝，使膽固醇和膽色素共同沉淀，實驗證明，這個方法較為成功。

（3）其他致石劑 石膽酸可增加低蛋白飼料在大鼠中的致石率已如前述；大劑量鵝去氧膽酸（CDCA）（0.50%）可提高Dam's飲食的致石作用，這可能與CDCA在腸道內轉化為有膽酸有關；去氫膽酸對小鼠有致石作用；雙氫膽固醇可誘發兔、豚鼠的膽酸類結石。Bengman曾用甲狀腺素在田鼠中誘發色素結石，用藥劑量為人類治療劑量的3～7倍；消膽胺（1.00%）可縮小膽酸池增加膽汁的致石性，在豚鼠和狒狒中已誘發了膽固醇結石，在豚鼠中的致石率也高達86.00%。

文獻中尚有報告用新霉素、考的松、雌激素等致石，但尚有一定爭議。

3 膽石模型的定向控制

為了獲得符合實驗要求的“成石膽汁”和結石類型，常需對致石動物進行“定向控制”，主要包括下列幾項措施。

3.1 選擇致石動物

已如前述，不同種系的動物成石特性很不一致，Redinger和Small將各種動物的膽汁成分標在A-S三角上，結果發現產生膽固醇結石的動物（如狒狒），膽汁坐標點接近或超過A-S曲線；而較易產生色素結石的動物（如牛、狗、豬等）坐標點遠離這一曲線；介于二者之間的動物，則產生膽固醇結石或膽色素結石的可塑性較大。應用這一方法，為選擇膽石模型創造了有利條件。

3.2 選擇致石方法

不同致石方法常可誘發不同類型的結石。如284號飲食可在倉鼠中誘發膽固醇結石；但換用甲狀腺飲食后即可產生膽色素結石；當混和使用295號飲食和甲狀腺飲食則大部分田鼠產生了混合結石。又如，給豚鼠注射林可霉素，可誘發色素結石，但是用消膽胺喂飼，則幾乎均產生了膽固醇結石。在兔、狗、大鼠和小鼠等實驗中亦有類似情況。

3.3 其他措施

為了使動物模型更接近于人類膽石病，近來已有人研究控制動物膽石結構和成石膽汁的措施。例如1979年Pearlman模擬人類高膽固醇飲食在田鼠中致石，用掃描電鏡研究膽石結構發現與人類結石十分相似，此外，成石過程中致石膽汁和肝酶的變化也與人類一致。這個過程還與人類一樣可用CDCA和熊去氧膽酸（UDCA）加以阻斷；又如鈴木用模擬日本人飲食習慣的低蛋白飼料在大鼠中致石。并用紅外光譜和薄層層析技術研究了大鼠色素石的特點，認為與日本人的膽石相似。為了獲得與人類相似的致石膽汁，也可采取一定的措施，如Hikasa用低脂飲食在小鼠和田鼠中致石，發現致石膽汁中亞油酸含量比人類低。于是重新調整了飼料中亞油酸的比例，結果動物致石膽汁就接近于人類的變化。

但這方面研究尚少，各項措施也不成熟，因此膽石病動物模型還不能完全代替臨床研究，僅能部分的反映膽石病的一般規律。

4 膽石動物模型的應用

4.1 探討膽石成因

利用動物模型可進行臨床上無法完成的實驗性研究，探討成石的一般規律。許多作者已在不同的動物中研究了膽道感染、代謝異常、神經激素紊亂和膽囊功能改變在致石中的作用，為病因學研究提供了重要線索。

4.2 尋找溶石和防石的藥物及療法

20世紀50年代初，Dam等就利用膽石模型研究過許多防石和溶石因素（如yeast、Vit C等），隨著新的溶石藥物的發現，動物模型對探討CDCA和UDCA以及Rowachol的機制起到了重要作用，近年來我國學者應用動物模型篩選和探尋中藥化石藥物也做了大量工作。

4.3 研究膽石病的病理生理特點

Gillman曾觀察動物致石與肝癌的關系；Scott等在許多種動物（兔、小鼠、豚鼠）中詳細研究了膽囊組織學變化與形成結石的關系。而動脈硬化、血脂水平的變化與膽石病的關系，以及心血管病變與膽石病的關系亦在動物模型中得到了研究。Pearlman還在動物中研究了膽石病與肝組織的變化，動物膽石模型的研究為膽石病的病理研究提供了重要資料。

4.4 其他

利用動物制備某些藥物，如人造牛黃、馬寶；提取CDCA和UDCA亦是實驗性膽石病研究的重要課題。

許多脊椎動物可產生膽石病，但不同種系的動物致石能力不同。運用膽道梗阻感染法、異物核心埋藏法、藥物注射法、植物神經刺激法和喂飼法可成功地制作膽石病的動物模型，其中低蛋白飲食喂飼法是誘發膽色素結石的常用方法。近年來醫學界已對膽石模型的定向控制技術引起重視，但進展尚少。膽石模型在研究膽石成因、病理和臨床治療上有一定的價值。

（收稿日期：2012-09-04）