HPLC法測定咖啡酸及咖啡酸片的含量

李明霞，張英芳，黃書芹

(1.德州德藥制藥有限公司，山東 德州 253015;2.德州市立醫院，山東 德州 253012)

咖啡酸為有機酸及酚類原料，其制劑咖啡酸片為止血升白細胞藥，具有收縮增固微血管、提高凝血因子的功能、升高白細胞和血小板的作用。咖啡酸與咖啡酸片的質量標準分別收載于國家食品藥品監督管理局局頒藥品標準與衛生部頒藥品標準(化學藥品與制劑)第一冊，均采用紫外－分光光度法(吸收系數法)測定其含量，由于紫外－分光光度法的影響因素較多，且供試品溶液制備過程較為繁瑣，本文參照咖啡酸局頒藥品標準中有關物質測定方法，采用高效液相外標法測定其含量，方法簡便，準確。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津 LC－10ATvp高效液相色譜儀，SPD－10Avp紫外檢測器，Anastar色譜工作站。

1.2 試藥 咖啡酸 (由德藥制藥有限公司提供，批號:111101、111201、111202);咖啡酸片(由德藥制藥有限公司提供，批號:111101、111102、111103);咖啡酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110885－200102);試驗用水為注射用水，甲醇為色譜純，冰醋酸為分析純。

2 試驗方法與結果

2.1 色譜分析條件及系統適用性 色譜柱:Sepax Sapphire C18柱(4.6mm ×250mm，5μm);流動相:甲醇 －0.32% 醋酸溶液(45∶55);檢測波長:323 nm;流速:1.0mL·min－1;進樣量:10μL。理論板數按咖啡酸峰計算應不低于3000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取咖啡酸對照品12.5mg，精密稱定，置50mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，精密量取5mL，置25mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度。

2.2.2 供試品溶液Ⅰ(咖啡酸)的制備 取咖啡酸12.5mg，精密稱定，置50mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，精密量取5mL，置25mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度。

供試品溶液Ⅱ(咖啡酸片)的制備:取咖啡酸片20片，精密稱定，研細，取細粉適量(約相當于咖啡酸12.5mg)，精密稱定，置50mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，濾過，精密量取續濾液5mL，置25mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按咖啡酸片處方比例稱取輔料適量，同法制備空白溶液。

2.3 干擾試驗 在上述色譜條件下，取對照品、供試品和陰性對照溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果在對照品色譜峰保留時間相應的位置上，供試品溶液有響應的峰，陰性對照溶液無對應峰，對樣品的測定無干擾，分離良好，見圖 1、2。

圖1 咖啡酸對照品色譜圖

圖2 陰性對照溶液色譜圖

2.4 線性關系及范圍 取咖啡酸對照品12.5mg，精密稱定，置50mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備液 1.0、3.0、5.0、7.0、9.0mL，分別置25mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，照“2.1”項色譜條件進行測定，記錄色譜圖，以對照品溶液濃度(C)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標，作線性回歸，得回歸方程A=47806C－5860.5，r=0.9998(n=5)。結果表明咖啡酸在 10 ～90 μg·mL－1范圍內，與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 回收率試驗 分別取處方比例的咖啡酸對照品及空白輔料適量，照測定濃度的80%，100%，120%制備供試品溶液，每個濃度制備3份，照正文含量測定方法測定，將測得峰面積代入線性方程，計算供試品中咖啡酸的含量，回收率試驗結果見表1。

表1 回收率試驗結果

2.6 精密度試驗 取線性試驗中濃度為50 μg·mL－1的咖啡酸對照品溶液，重復進樣6次，按咖啡酸峰面積計算得RSD=0.67%(n=6)，結果表明進樣精密度良好。

2.7 重復性試驗 取同一批號咖啡酸及咖啡酸片各6份，按正文方法測定，結果表明含量平均值分別為100.1%、99.6%，RSD 分別為0.86%、0.99%，表明本分析方法重復性較好。

2.8 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8 h取10μL注入液相色譜儀，測定其峰面積，RSD=1.06%，表明本品溶液在8 h內穩定。

2.9 樣品測定 按正文擬定方法分別測定3批咖啡酸及咖啡酸片的含量，測定結果見表2。

表2 咖啡酸及咖啡酸片樣品測定結果

3 討論

3.1 流動相、色譜柱的選擇均參照咖啡酸局頒質量標準中有關物質的測定。

3.2 檢測波長的選擇 取對照品溶液進行紫外掃描，結果咖啡酸在323 nm波長處有最大吸收，故選擇323 nm作為檢測波長，可用于含量測定。

3.3 本方法線性關系試驗、回收率試驗、精密度等試驗均良好，適用于咖啡酸及咖啡酸片的含量測定，方法簡單、精密度高、結果準確可靠。