自體MSCs/Chondro－Gide?工程化軟骨再生修復技術的大動物實驗

左鎮華，米彥軍，方禮明，林 娜，張 軍，鄭繼元，楊 柳

關節軟骨損傷及其修復，長期以來是困擾骨科基礎研究與臨床治療的棘手問題。隨著高能高速創傷的不斷增多及人口老齡化進程，導致和加速關節軟骨損傷和退變的疾患將顯著增加。目前臨床治療關節軟骨缺損的方法均存在缺陷。因此，開發一種新型軟骨再生修復技術具有十分重要的意義。本實驗在AMIC技術的基礎上，結合干細胞移植技術［1］，通過關節鏡或小切口微創方式進行關節軟骨缺損的修復，具有操作簡單，創傷小等特點，避免了軟骨細胞取材對供區的損傷，減省了體外軟骨構建過程，借助關節腔的生物及力學環境更有利于骨髓間充質干細胞的自我誘導，實現損傷部位軟骨修復，從而為軟骨損傷修復的臨床前實驗提供大動物實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 Stryker關節鏡系統、JVC視頻監視系統、Stryker電動削刨系統、帶刻度的關節鏡探針、microfracture手錐、電動磨鉆，骨髓穿刺包，DMEM培養液:含有L－谷氨酰胺300 μg/ml，維生素C 50 300 μg/ml，青霉素及鏈霉素各100 μg/ml的無血清DMEM(美國Gibco)培養液，Chondro－Gide?Ⅰ/Ⅲ型膠原雙層薄膜支架(瑞士蓋氏公司)，Percoll分離液，優質胎牛血清(美國Hycline Logan)，磷酸鹽緩沖液(PBS)，醫用生物蛋白膠(廣州倍繡生物技術有限公司)，SHEL－LAB2300型二氧化碳培養箱(美國Sheldo)，IX70－CK2型生物倒置顯微鏡(日本Olympus)等。

1.2 實驗動物 中國青山羊12只，12月齡，體重14.5～15.5 kg，雌雄不限，雄性未去勢(第三軍醫大學實驗動物中心提供)。

1.3 實驗方法

1.3.1 建立山羊關節軟骨缺損模型

1.3.1.1 制造4 cm2缺損區域微骨折最大數并計算干細胞移植的細胞量 在處死山羊的股骨滑車上制造軟骨缺損4 cm2，用關節鏡微骨折手錐(孔徑2.5～2.8 mm，深度3～4 mm，孔間間隔為2～3 mm)最大限度制造微骨折;測量微骨折手錐的尖端直徑及長度，測量制造的微骨折孔徑的直徑。

1.3.1.2 參照以下幾個標準化數值 (1)臨床上注射的細胞懸液的濃度3 ×107/ml［2］;(2)4 ml成人骨髓含3.2×107～6.0×107個單個核細胞，培養3周收獲hMSCs 2.5×107～4.3×107，4 ml成人骨髓培養3周所需血清30 ml［3］;(3)200 ml全血可提取血清120 ml(北京積水潭醫院檢驗科提供數值)。

1.3.2 自體MSCs/Chondro－Gide?工程化軟骨修復技術具體步驟 (1)實驗分組:12只成年中國青山羊，將山羊按序編為1～12號，隔離后驗血，排除腦膜炎后隨機分為實驗組、AMIC治療組及空白對照組，每組4只8膝。(2)采集山羊血液，培養自體血清通過山羊頸靜脈采集120 ml全血，制備自體血清。(3)骨髓的采集:肌注氯胺酮(10～20 mg/kg)后進行稱重。采用戊巴比妥鈉(20～30 mg/kg)靜脈復合麻醉，成功后以10%Na2S溶液褪去山羊膝關節手術區域毛發，以碘伏常規術區消毒、鋪巾，肝素化的無菌骨穿針以45°傾斜于股骨近端沿其長軸的方向，進入骨髓腔后抽取骨髓3～5 ml，置于肝素化的無菌離心管中。(4)骨髓間充質干細胞的自體血清體外培養。(5)制備山羊膝關節股骨滑車關節面缺損模型以10%Na2S溶液褪去山羊膝關節手術區域毛發，以碘伏常規術區消毒、鋪巾，制作膝關節滑車部位4 cm2軟骨缺損模型。

1.3.3 動物實驗操作 制備骨髓間充質干細胞懸液待用。實驗組:首先清理關節軟骨缺損部位，修整周緣，用消毒后的鋁箔填充缺損部位，修剪鋁箔與軟骨缺損形狀及大小一樣作為模具，將模具覆蓋在Chondro－Gide?薄膜上，沿邊緣修剪;在軟骨缺損部位制造微骨折，注射纖維蛋白凝膠，將修整后的薄膜覆蓋缺損部位，將細胞懸液均勻注射在薄膜下，髕骨復位后被動活動膝關節，檢查薄膜固定牢固性;AMIC組:單純微骨折加貼薄膜;空白對照組:注入無菌生理鹽水1 ml。術后連續3 d肌肉注射青霉素，40萬U/只，動物肢體不固定，正常飲食，動物自由活動。

1.4 觀察指標

1.4.1 術后一般情況 動物飲食量、肢體活動、傷口愈合情況、有無全身或局部感染等。

1.4.2 關節鏡后膝關節MRI檢查 術后8周動物麻醉后行關節鏡觀察及膝關節MRI檢查。

1.4.3 大體觀察 處死動物，手術顯露膝關節，肉眼觀察關節有無粘連、有無關節內游離體，以及修復組織色澤、修復面積、修復厚度及與周圍組織整合情況。

1.4.4 組織學觀察 大體觀察完成之后，截取修復的股骨遠端，4%多聚甲醛固定48 h，0.5M的EDTA(由不含鈣、鎂的PBS配制，NaOH調整pH 7.8)脫鈣3周、每周更換脫鈣液2次，石蠟包埋切片，HE、TB染色。行組織形態和軟骨細胞分泌氨基多糖定性觀察。

1.4.5 修復效果評分 采用半定量改良的Wakitani評分法［4］，觀察修復組織細胞種類、基質染色、修復面積、軟骨厚度及與正常組織的整合情況。

1.5 統計學處理 應用SPSS10.0統計分析軟件ANOVA方差分析法，分析三組軟骨修復Wakitani評分值，進行各組間均數(±s)的比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 計算數值的結果 4 cm2軟骨缺損的微骨折孔數(Max):25個;4 cm2軟骨缺損微骨折注入液體總量=25×13 μl=0.32 ml;4 cm2軟骨缺損注入液體總量=1.6 ml;細胞總數=3×107/ml×0.32﹢1.6×3×107/ml=4.6×107/ml;所需要采集的骨髓總量=7.36 ml～4.28 ml;所需血清50～60 ml;需采集全血最大量83～100 ml。

2.2 一般情況 修復術后次日，動物活動量及飲食較前略減少，術后3 d大多數實驗動物恢復正常飲食，術后7 d全部恢復正常活動;術后7 d切口愈合，縫線自動脫落。

2.3 術后8周關節鏡下觀察 實驗組:關節腔滑膜無增生、充血，關節腔無積液，軟骨缺損部位邊界光滑，表面光滑無起層，彈性尚可。AMIC組:關節鏡下可見關節腔少量積液，滑膜有增生，修復區色澤較正常軟骨差別大，軟骨表面光滑但低于正常軟骨，彈性差。空白對照組:軟骨缺損仍存在，缺損周緣有類似纖維肉芽組織增生(圖1)。

2.4 術后8周大體觀察 軟骨修復術后時，大體觀察:實驗組:修復區表面平整，修復區域色澤較接近周圍正常軟骨，邊界連續無分裂;AMIC組:修復區表面較為平整，色澤暗紅與周圍正常組織區別明顯;空白對照組:仍可見明顯缺損，缺損底部肉芽組織形成。

2.5 術后8周膝關節核磁共振影像學評價 (1)實驗組:關節腔無積液，滑膜無增生，軟骨表面光滑，無缺損;(2)AMIC組:軟骨下骨有異常信號改變，軟骨表面較為光滑，髕下脂肪墊增生;(3)空白對照組:軟骨及軟骨下骨缺損，T2像可見關節腔少量積液(圖2)。

2.6 軟骨修復術后8周時，組織學觀察 (1)實驗組:HE染色示修復區域與正常組織整合較好，有較多幼稚軟骨細胞，修復組織表層下方，細胞體積較小，形態多長梭形，數量多，分布均勻，深層細胞體積較大，排列不規則，能見到伊紅深染的少量支架;(2)AMIC組:可見修復區整合尚可，表層下方類似骨髓細胞聚集，細胞數量較少、體積小，排列不規則;(3)空白對照組:缺損區邊緣可見軟骨組織反應性增生，但不能充填缺損，缺損底部為增生的纖維組織，并有毛細血管長入(圖3)。

2.7 修復效果 Wakitani評分結果實驗組8周、16周評分值與空白對照組相應評分值比較差異有統計學意義(P＜0.01);實驗組8周、16周評分值與AMIC組相應時刻評分值比較差異有統計學意義(P＜0.01);AMIC組8周評分值與空白對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01);AMIC組16周評分值與空白對照組相應時刻評分值比較無統計學差異(P＞0.05)，見表1。改良Wakitani評分結果顯示:實驗組和AMIC組修復效果均優于空白對照組，且實驗組修復效果更優于AMIC組。

圖3 軟骨修復術后8周組織學觀察(HE，×100)

表1 自體MSCs/Chondro－Gide?工程化軟骨修復技術修復關節軟骨缺損Wakitani評分值(n=8;±s)

表1 自體MSCs/Chondro－Gide?工程化軟骨修復技術修復關節軟骨缺損Wakitani評分值(n=8;±s)

注:與空白對照組比，①P＜0.01;與AMIC組比，②P＜0.01

組別 8周 16周實驗組 4.63±1.18①② 3.95±1.02①②11.35±1.86 8.25±1.38 AMIC組 8.70±0.82① 7.06±1.13空白對照組

3 討 論

本實驗按照自體MSCs/Chondro－Gide?工程化軟骨修復技術修復山羊膝關節股骨滑車軟骨缺損，進一步驗證微創條件下臨床應用的可行性，自體血清培養骨髓間充質干細胞的可行性，利用膠原蛋白凝膠固定Chondro－Gide?薄膜固定方式的有效性，計算出一定面積的軟骨缺損需要采集的骨髓及全血最大量，為臨床應用奠定基礎。

3.1 間充質干細胞誘導軟骨再生可行性分析 間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在一定的誘導條件下，可向軟骨細胞分化，經體外實驗證實具有軟骨細胞的形態和分泌軟骨基質的能力。MSCs可來源于骨髓、骨膜或軟骨膜，具有多向分化潛能，根據環境的不同可分化為軟骨、骨、肌腱等。它們傳代繁殖能力強，連續多次傳代仍可保持良好的增殖分化活性，與基質材料復合植入體內后可在新生組織上部形成良好的透明樣軟骨，而在軟骨下區則形成骨組織，從而可達到很好的界面整合。其中，骨髓來源的MSCs(骨髓基質干細胞bone marrow stem cells，BMSC)取材方便，分離和培養簡單，成人一次骨穿取材后體外可連續培養30代以上，數量擴增一百萬倍以上而依然保持良好的多向分化潛能。而且，雖然BMSC濃度隨年齡增長而下降，但其活性依然良好，故有些專家認為BMSC是關節軟骨缺損修復的首選種子細胞［5－7］。

3.2 自體血清培養骨髓間充質干細胞的可行性分析 組織工程骨從種子細胞的體外擴增到組織的構建與成熟都離不開血清，不同種類甚至不同批號的血清對于MSCs的貼壁、擴增以及多系潛能的維持均有不同的效果［8］。目前動物實驗和臨床試驗普遍使用的都是牛血清，而組織工程走向臨床需要符合生物安全性的產品，為了避免異種血清帶來的免疫原，無血清培養技術將是今后的發展方向，但是目前其促增殖效率尚不滿意，自體血清代替動物血清可能是今后一段時期內的解決方案［9］。臨床上如采用自體血清培養骨髓間充質干細胞獲取足夠的種子細胞符合倫理委員會相關規定。

3.3 關節鏡下制備膝關節軟骨缺損的優越性 研究證實關節的機械應力決定關節軟骨的修復;開放性手術具有視野清楚、操作方便的優點，但其創傷較大，有可能造成一些不可逆的關節損害，破壞關節的正常應力，從而影響實驗結果。本實驗研究通過關節鏡制備了山羊膝關節軟骨缺損模型。在不打開關節囊、不破壞關節內部結構的條件下完成了關節腔內關節軟骨缺損的制備、microfracture治療及種子細胞的注入。術后關節腔未發生感染，關節功能恢復較快。進一步證實設計方案是切實可行的［10］。

3.4 利用膠原蛋白凝膠固定Chondro－Gide?薄膜可行性 通過動物模擬實驗，術中能不損傷正常組織情況下簡單、有效牢固地固定薄膜，無脫落、起層、皺褶的發生，術后在不制動的條件下膝關節MRI影像學檢查證實薄膜無脫落，關節鏡探查進一步證實移植物無脫落，組織學檢測證實移植物和正常組織結合較好。并且，該操作可以在關節鏡下進行，具有簡易性、微創性、快捷性等特點，因此該固定方式臨床應用切實可行。

3.5 關節軟骨缺損修復的可能途徑 體內關節軟骨損傷后可能的修復途徑有:(1)注射的MSCs向病灶部位定向遷移，局部自我誘導分化［11］;(2)損傷周圍極少數軟骨細胞的有絲分裂;(3)microfracture后軟骨下骨髓間充質干細胞的誘導分化;局限于軟骨層的缺損，缺損邊緣極少數軟骨細胞可出現有絲分裂現象，基質和細胞增殖遷移，合成基質增加，呈現有限的內源性修復。全層軟骨缺損，軟骨下骨MSCs進入缺損區，在特定環境中向軟骨細胞分化修復缺損［12］;(4)干細胞移植增加骨髓間充質細胞在缺損部位的有效濃度［13］。

3.6 存在的問題與不足 本實驗軟骨組織在物種之間差異很大，因此軟骨缺損模型的選擇上，馬等大動物能更好模擬人的關節力學和生物學。此外，觀察期較短，缺乏6個月以上組織學檢查及關節鏡、膝關節MRI觀察;沒有對修復軟骨組織進行相關力學測試，所修復透明軟骨樣組織能否長期保持，是否發生軟骨退化，是否具備關節軟骨的力學要求都需要進一步追蹤研究。

本實驗在術后的關節制動及后期的康復性功能鍛煉沒有很好的模擬驗證。隨著研究的進一步深入，種子細胞、生物支架以及組織構建等方面不斷優化改進，相信在不久的將來，組織工程技術將給以組織和器官修復為主的外科學帶來革命性變化和廣闊的臨床應用前景。

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