瑞香狼毒總黃酮提取物對肺癌細胞增殖及細胞周期的影響

段 昕，賈春芳

（河北省張北縣中醫院內科，河北張北 076450）

·論 著·

瑞香狼毒總黃酮提取物對肺癌細胞增殖及細胞周期的影響

段 昕，賈春芳

（河北省張北縣中醫院內科，河北張北 076450）

目的研究瑞香狼毒總黃酮提取物對肺癌A549細胞的增殖抑制、細胞周期的影響。方法采用超聲波技術提取瑞香狼毒根中的總黃酮。四甲基偶氮唑鹽法檢測總黃酮提取物對A549細胞的增殖抑制作用，流式細胞儀檢測總黃酮提取物對A549細胞周期和凋亡的影響。結果瑞香狼毒總黃酮提取物呈明顯的時間-劑量依賴性抑制A549細胞的增殖，即隨著時間的延長、總黃酮提取物濃度的增加，抑制作用增強；總黃酮提取物可誘導A549細胞凋亡，并將A549細胞阻滯在G1期。結論瑞香狼毒總黃酮提取物具有抗肺癌的活性。

狼毒大戟；黃酮；肺腫瘤

肺癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一。在我國，肺癌的發病率和病死率均居各種惡性腫瘤的首位［1］。傳統手術、藥物等治療方法仍是目前治療肺癌的重要手段，但是由于其較強的不良反應，使得部分患者因為不能耐受而不得不中斷治療。近年來，中草藥在治療惡性腫瘤中表現出增效減毒作用而備受關注，為尋求防治肺癌及其他腫瘤性疾病開辟了一條新路。但中草藥治療疾病目前大多數仍停留在經驗階段，缺乏具體的藥物成分、藥效機制、安全性及不良反應等相關研究的驗證［2］。本研究觀察了不同濃度瑞香狼毒總黃酮提取物對肺癌A549細胞的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及藥材：肺癌細胞株A549購自中科院細胞庫；瑞香狼毒根購自東莞中草藥公司。

1.1.2 試劑及藥品：RPMI1640培養基購于北京欣興唐生物科技有限公司；胰蛋白酶、核糖核酸酶-A、四甲基偶氮唑鹽（3-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide，MTT）溶液和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自Sigma公司；胎牛血清購自Gibico公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：A549細胞培養于含6m L 10%小牛血清的RPMI1640培養基中，培養條件為37℃、5%CO2。每2～3d傳代1次。

1.2.2 瑞香狼毒總黃酮提取：將瑞香狼毒根碾磨成粉，稱取500g。采用無水乙醇浸泡過夜，超聲波提取3次，每次30min，溫度為55℃。取無水乙醇提取物加入石油醚30mL萃取，重復3次。再將提取液于旋轉蒸發儀內減壓濃縮。濃縮產物加蒸餾水50mL 60℃水浴2h后過濾，揮發。最后所得到的產物即為總黃酮提取液。-4℃保存備用。

1.2.3 MTT法檢測細胞生長抑制：將對數生長的細胞以每孔200μL的濃度加入96孔培養板中，于37℃、5%CO2培養箱中培養48h后，離心去除上清液，實驗孔分別加入終濃度為10、20、40、60、80mg/L的總黃酮提取物，每種濃度設5個復孔。另設空白組和對照組（不加總黃酮提取物，0mg/L）。24、48、72h后每孔加入MTT 20μL（5g/L），37℃孵育4h，棄上清，每孔加入DMSO 150μL，振搖30 min。用空白組調零，于酶標儀檢測波長490 nm處每孔吸光度（absorbance，A）值求其平均值，計算細胞生長抑制率。以藥物濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標繪制生長曲線圖。重復3次。細胞生長抑制率=（對照組A值-試驗組A值）/對照組A值×100%。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡和周期：取對數生長期的細胞，調整細胞的初濃度至2×105個/mL加入7個培養瓶當中，加入不同濃度的總黃酮提取液，分別為終濃度為10、20、40、60、80mg/L，并另設空白組和對照組，共7組。48h后用胰蛋白酶消化收集細胞，1 200r/min離心5min收集細胞。24h后加預冷的0.5mL PBS液吹打混勻。將細胞吸起5mL至70%乙醇中24h后1 200r/min離心5min。收集細胞加入0.4m L PBS和6μL RNase-A，37℃水浴40min。加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）約50μL 4℃避光染色15min。用300目尼龍網過濾后流式細胞儀檢測細胞凋亡率和細胞周期。以上實驗重復3次。

1.3 統計學方法：應用SPSS15.0軟件進行統計分析，計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 細胞生長抑制實驗結果：不同濃度的瑞香狼毒總黃酮提取物處理人肺癌細胞A549 24、48、72h后，用MTT法檢測細胞的活性。結果顯示，瑞香狼毒總黃酮提取物呈明顯的時間-劑量依賴性抑制A549細胞的增殖。藥物在低濃度時對A549細胞抑制作用不是很明顯，但是隨著提取物濃度的增加，抑制效果顯著增強；在相同濃度藥物的情況下，隨著作用時間的延長，抑制率增大。采用80mg/L提取物作用A549細胞72h后，抑制率高達79.3%。見表1。

表1 不同濃度瑞香狼毒總黃酮提取物作用24、48及72h后對A549細胞的抑制率

2.2 細胞凋亡檢測結果：采用不同濃度總黃酮提取物處理肺癌細胞A549 48h后，用流式細胞儀檢測凋亡情況。總黃酮提取物10、20、40、60、80mg/L處理后的細胞凋亡率分別為（9.03±0.32）%、（10.48±0.41）%、（12.71±0.23）%、（16.09± 0.61）%、（30.99±1.56）%、（51.6±2.87）%，與對照組（6.98±0.32）%相比差異有統計學意義（P＜0.05），且各干預組兩兩比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 細胞周期檢測結果：分析結果顯示，A549細胞經不同濃度總黃酮提取物處理48h后，細胞G0/G1期細胞增多，S和G2/M期細胞減少。隨著藥物的濃度增加，G0/G1期細胞從（45.6±5.6）%（0mg/L）升高到（83.9±7.9）%（80mg/L）；S期細胞從（27.3 ±3.2）%（0mg/L）降低到（16.1±3.8）%（80mg/ L）；G2/M期細胞從（15.0±2.6）%（0mg/L）降低到（5.9±1.0）%（80mg/L）（圖1）。這表明總黃酮提取物可使細胞阻滯于G1期。

3 討 論

瑞香狼毒是瑞香科狼毒屬多年生草本有毒植物，為傳統中藥，性味苦平，具有殺菌、殺蟲、散結等功效。國內研究顯示瑞香狼毒具有一定的抗肺癌作用效果［3］。楊寶印［4］采用瑞香狼毒治療惡性腫瘤54例，其中包括肺癌6例，治療1個月以上有效率為63%，1年生存率達16%，顯著高于對照組的4.6%（P＜0.05），提示瑞香狼毒具有抑制腫瘤細胞增殖的功效。陳偉等［5］同樣發現用狼毒與雞血藤、苡米、半枝蓮等制成復方狼毒注射液可用于治療晚期肺癌。但瑞香狼毒抗腫瘤的有效成分及其作用機制仍不清楚。

狼毒的主要成分包括香豆素類、黃酮類、二萜類、三萜類、木質素類等［6］。瑞香狼毒的有效成分對肺癌細胞或其他腫瘤細胞具有一定的抑制、促凋亡作用。樊俊杰等［7］分別觀察了瑞香狼毒水和醇提取物對小鼠lewis肺癌細胞生長影響。瑞香狼毒水提物5～20g/kg對小鼠lewis肺癌生長抑制率為10.9%～40.6%；醇提物2.5～10g/kg對lewis肺癌生長抑制率為20.1～40.8%，且呈劑量反應關系。其他研究［8-9］同樣發現瑞香狼毒水和醇提取物對肺癌細胞增殖、凋亡具有一定的效果。雖然采取了水或醇的提取，但提取物中的成分仍然十分的復雜。目前，越來越多的研究致力于探索瑞香狼毒的具體成分。如采用色譜法分離出的活性成分gnidimacrin具有較強的抗腫瘤活性，具有一定的臨床應用價值。

目前，國內外尚未見采用超聲波方法提取瑞香狼毒中總黃酮作用于肺癌細胞的研究報道。王敏等［10］觀察了瑞香狼毒總黃酮提取物的抗人胃癌細胞SGC-7901、人肝癌細胞BEL-7402和人白血病細胞HL-60的效果。MTF法檢測結果表明，瑞香狼毒總黃酮提取物與長春新堿對體外培養的人胃癌細胞SGC-7901和人肝癌細胞BEL-7402增殖都表現出較強的抑制作用，呈現較好的劑量依賴性抑制作用，且瑞香狼毒總黃酮提取物的急性毒性小。本研究首次觀察超聲波法提取瑞香狼毒總黃酮成分作用肺癌細胞A549。結果顯示瑞香狼毒總黃酮提取物呈明顯的時間-劑量依賴性抑制A549細胞的增殖，即隨著時間的延長、總黃酮提取物濃度的增加，抑制作用增強，采用80mg/L提取物作用A549細胞72h后，抑制率高達79.3%。總黃酮提取物可誘導A549細胞凋亡，并將A549細胞阻滯在G1期。本研究初步結果顯示瑞香狼毒總黃酮提取物具有抗肺癌細胞的活性，但瑞香狼毒總黃酮通過何種途徑抑制肺癌細胞增殖、誘導凋亡等具體的作用機制，除了A549肺癌細胞株，對其他類型的肺癌細胞是否有同樣的效果還有待于進一步的研究。

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［5］ 陳偉，王俊英，張麗嵐，等.復方狼毒散治療晚期肺癌［J］.中華臨床醫學研究雜志，2004，10（95）：2036-2037.

［6］ 張慧文，鞠愛華，周秀娟.瑞香狼毒化學成分與生物活性研究進展［J］.中藥材，2006，29（11）：1257-1261.

［7］ 樊俊杰，賈正平，謝景文，等.瑞香狼毒對小鼠移植肺瘤生長的影響［J］.蘭州醫學院學報，1994，20（4）：228-230.

［8］ 劉曉霓，李玉潔，楊慶，等.瑞香狼毒醇提物體外抗腫瘤作用研究［J］.中國中藥雜志，2010，35（22）：3048-3051.

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［10］ 王敏，賈正平，馬駿，等.瑞香狼毒總黃酮提取物的抗腫瘤作用［J］.中國中藥雜志，2005，30（8）：603-606.

（本文編輯：趙麗潔）

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1007-3205（2012）03-0308-03

2011-12-16；

2012-01-30

段昕（1974-），男，河北張北人，河北省張北縣中醫院主治醫師，醫學學士，從事內科疾病診治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.03.023