胃癌組織Pokem on和p14ARF表達率及其在臨床生物學行為中的意義

賈 楠，劉月平，李 勇*

（1.河北醫科大學第四醫院外三科，河北石家莊 050011；2.河北醫科大學第四醫院病理科，河北石家莊 050011）

·論 著·

胃癌組織Pokem on和p14ARF表達率及其在臨床生物學行為中的意義

賈 楠1，劉月平2，李 勇1*

（1.河北醫科大學第四醫院外三科，河北石家莊 050011；2.河北醫科大學第四醫院病理科，河北石家莊 050011）

目的探討胃癌組織中Pokemon、p14ARF蛋白表達率及其與臨床生物學行為的關系。方法取手術切除胃癌組織標本50例，正常胃黏膜組織標本20例，用免疫組織化學方法檢測胃癌組織、正常胃黏膜組織Pokemon和p14ARF蛋白的表達，并且分析二者表達情況與胃癌患者性別、年齡、腫瘤部位、瘤體大小、大體分型、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期等臨床生物學特征的關系。結果①在胃癌組織和正常胃黏膜組織中Pokemon和p14ARF均表達于細胞核，在陽性染色的細胞核中呈現棕黃色顆粒。Pokemon蛋白表達率在胃癌組織中為78%，在正常胃黏膜組織中為45%，二者差異有統計學意義（P＜0.05）。p14ARF蛋白表達率在胃癌組織中為42%，在正常胃黏膜組織為90%，二者差異有統計學意義（P＜0.05）。②胃癌組織中Pokemon蛋白表達率在有淋巴結轉移組為87.5%，在無淋巴結轉移組為40%，二者差異有統計學意義（P＜0.05）。隨著腫瘤增大、浸潤程度加深及臨床分期升高，胃癌組織中Pokemon蛋白表達有升高趨勢。③胃癌組織中p14ARF蛋白表達率在有淋巴結轉移組為37.5%，在無淋巴結轉移組為80%，二者差異有統計學意義（P＜0.05）。隨著腫瘤分化程度的降低、浸潤程度的加深及臨床分期的升高，胃癌組織中p14ARF蛋白表達有降低的趨勢。④胃癌組織中，Pokemon與p14ARF蛋白表達呈現負相關（r=-0.280，P=0.049）。結論胃癌組織Pokemon高表達和p14ARF低表達可反映胃癌的發生發展、侵襲及轉移等臨床生物學行為的程度。

胃腫瘤；Pokemon蛋白；腫瘤抑制蛋白質；p14ARF

胃癌是人類最常見的消化系統惡性腫瘤。胃癌的發生與轉歸是一個機制復雜的過程，其中分子生物學機制主要有癌基因激活和抑癌基因失活。Pokemon基因（POK erythroid ontogenic factor）為原癌基因，在細胞分化過程中具有多效性功能。該基因通過抑制某些抑癌基因，致細胞內抑制機制缺陷和細胞增殖失控，進而發生腫瘤［1］。可變閱讀框（alternative reading frame，ARF）基因通過編碼p14ARF腫瘤抑制蛋白參與細胞周期調控和p53途徑，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤形成［2］。本研究采用免疫組織化學法（streptavidin peroxidase，SP）檢測胃癌組織及正常胃黏膜組織中Pokemon和p14ARF蛋白的表達及其在臨床生物學行為中的作用，以探討Pokemon和p14ARF在胃癌發生與轉歸中的意義，為胃癌臨床分子生物學分期、預后及指導綜合治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料：收集河北醫科大學第四醫院外三科2006年10月—2009年8月接受手術切除治療的胃癌組織標本50例，其中男性38例，女性12例；＜50歲者12例，≥50歲者38例，年齡37～75歲，中位年齡56歲。腫瘤位于賁門與胃底部7例，胃體部20例，胃竇部23例；直徑＜5.0cm者25例，≥5.0cm者25例；局限型（BorrmannⅠ、Ⅱ）24例，浸潤型（BorrmannⅢ、Ⅳ）26例；高和中分化腺癌21例，低分化腺癌29例；浸潤深度為T1+T2 9例，T3+T4 41例；有淋巴結轉移者40例，無淋巴結轉移者10例；臨床分期為Ⅰ+Ⅱ期9例，Ⅲ+Ⅳ期41例。另取正常胃黏膜組織標本20例（距癌灶邊緣＞5.0cm，經病理學證實無腫瘤細胞）作為對照組。所有患者術前均未經放療和化療，其臨床記錄均按照“全國胃癌診治規范”［3］進行登記。

1.2 試劑與方法：取手術切除的胃癌組織、正常胃黏膜組織標本放入10%甲醛固定24h，常規石蠟包埋，4μm連續切片。用免疫組織化學SP法測定胃癌組織標本中Pokemon和p14ARF。按試劑盒說明進行（北京中杉生物技術有限公司）。Pokemon一抗為兔抗人多克隆抗體（美國ProMab公司），p14ARF鼠抗人單克隆抗體（美國Cell Signaling公司），均購自河北海森生物技術開發有限公司。抗體的稀釋度為1∶200。以PBS代替第一抗體的胃癌組織免疫組織化學染色結果作陰性對照；試劑盒自帶陽性片免疫組織化學染色結果作為陽性對照。

1.3 實驗結果判斷：免疫組織化學結果判定標準，光鏡下，Pokemon蛋白和p14ARF蛋白表達主要定位于細胞核，以胞核中出現明顯棕黃色顆粒為陽性細胞。參考Fromowitz陽性細胞半定量分級法，觀察整張切片，根據陽性細胞所占的百分數計分，≤5%計0分，＞5%～25%計1分，＞25%～50%計2分，＞50%～75%計3分，＞75%計4分；再根據陽性細胞染色強度計分，無著色計0分，淡黃計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；兩者積分相加所得的總分，按照0～1分為（-），2～3分為（+），4～5分為（++），6～7分為（+++）。以（-）和（+）定為低表達，（++）和（+++）定為高表達。

1.4 統計學方法：應用SPSS12.0統計軟件包進行數據處理，計數資料以百分率表示，采用χ2檢驗，相關性采用Spearman等級相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 胃癌組織及正常胃黏膜組織中Pokemon蛋白的表達：在胃癌組織和正常胃黏膜組織中Pokemon主要表達于細胞核，陽性染色的細胞核中呈現出棕黃色細顆粒（圖1）。胃癌組織中Pokemon蛋白表達39例（78%），正常胃黏膜組織中表達率（45%），二者差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 Pokemon和p14ARF在胃癌組織與正常胃黏膜組織中的表達Table 1 Expression of Pokemon and p14ARFin gastric carcinoma tissues and normal gastricmucosa

2.2 胃癌組織Pokemon蛋白表達及其在臨床生物學行為中的意義：有淋巴結轉移組的胃癌組織中Pokemon蛋白表達率為87.5%，無淋巴結轉移組為40.0%，二者差異有統計學意義（P＜0.05）；胃癌組織Pokemon蛋白表達在患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、大體分型、分化程度、浸潤深度、臨床分期等因素間均差異無統計學意義（P＞0.05）。但是，Pokemon蛋白表達率隨著腫瘤的增大（直徑≥5.0cm組較直徑＜5.0cm組）、浸潤程度的加深（T3+T4組較T1+T2組）和臨床分期的升高（Ⅲ+Ⅳ期組較Ⅰ+Ⅱ期組）有升高趨勢，見表2。

2.3 胃癌組織及正常胃黏膜組織中p14ARF蛋白的表達：胃癌組織和正常胃黏膜組織中p14ARF蛋白主要表達于細胞核，陽性細胞染色呈核內棕黃色細顆粒狀（圖2）。胃癌組織中p14ARF蛋白表達率42%，正常胃黏膜組織90%，二者差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表2 胃癌組織中Pokemon表達與臨床組織病理特征的關系Table 2 Correlation between the expression of Pokem on in gastric carcinoma tissues and clinical histopathologic characteristics

Body of stomach 20 18（90.0）2（10.0）1.828 0.176 Sinus ventriculi 23 17（739）6（26.1）0.719 0.397 Tumor diameter（L/cm）＜5 25 18（72.0）7（28.0）≥5 25 21（84.0）4（16.0）1.049 0.496 Typing Localized type 24 19（79.2）5（20.8）Infiltrating type 26 20（76.9）6（23.1）0.037 0.848 Differentiation High and Moderate 21 17（80.9）4（19.1）Low 29 22（79.3）7（20.7）0.007 0.741 Depth of invasion T1+T2 9 5（55.6）4（44.4）T3+T4 41 34（70.7）7（29.3）0.239 0.628 Lymph nodemetastasis Yes 40 35（87.5）5（12.5）No 10 4（40.0）6（60.0）7.933 0.004 Tumor stageⅠ～Ⅱ9 6（66.7）3（33.3）Ⅲ～Ⅳ41 33（80.5）8（19.5）0.214 0.392

2.4 胃癌組織p14ARF蛋白表達及其臨床生物學行為的意義：有淋巴結轉移組的胃癌組織中p14ARF蛋白表達率為37.5%，無淋巴結轉移組為80.0%，二者差異有統計學意義（P＜0.05）。胃癌組織中p14ARF蛋白表達在患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、大體分型、分化程度、浸潤深度、臨床分期等因素間均差異無統計學意義（P＞0.05）。但是，p14ARF蛋白表達率隨著分化程度的降低（低分化組較高和中分化組）、浸潤程度的加深（T3+T4組較T1+T2組）和臨床分期的升高（Ⅲ+Ⅳ期組較Ⅰ+Ⅱ期組）有降低趨勢，見表3。

表3 胃癌組織中p14ARF表達與臨床組織病理特征的關系Table 3 Correlation between the expression of p14ARFin gastric carcinoma tissues and clinical histopathologic characteristics

Typing Localized type 24 10（41.7）14（58.3）Infiltrating type 26 11（42.3）15（57.7）0.002 0.963 Differentiation High andmoderate 21 9（42.9）12（57.1）Low 29 12（41.4）17（58.6）0.011 1.000 Depth of invasion T1+T2 9 4（44.41）5（55.6）T3+T4 41 17（43.9）24（56.1）0.018 0.896 Lymph nodemetastasis Yes 40 13（37.5）27（62.5）No 10 8（80.0）2（20.0）4.147 0.042 Tumor stageⅠ～Ⅱ9 4（44.4）5（56.6）Ⅲ～Ⅳ41 17（43.9）24（56.1）0.044 0.716

2.5 胃癌組織中Pokemon與p14ARF蛋白表達的關系：胃癌組織中，Pokemon與p14ARF蛋白表達率呈明顯負相關（r=-0.280，P=0.049），見表4。

表4 胃癌組織中Pokemon與p14ARF表達的相關性分析Table 4 Correlations between the exp ression of Pokemon and p14ARFin gastric carcinoma tissues

3 討 論

Pokemon蛋白是由ZBTB7基因編碼的具有584個氨基酸的蛋白質［4］，在多種組織中都有表達。Morrison等［5］通過Northern Blot分析發現Pokemon mRNA表達于人外周血白細胞、結腸、小腸和卵巢，同時通過Western Blot分析還發現所有人類細胞系（包括HeLa、Jurkat、BJAB和Raji細胞）都存在Pokemon蛋白的表達。Davies等［6］發現人和鼠Pokemon基因廣泛表達于成熟組織和細胞系。乳腺癌T47D細胞系及成人皮膚組織中均存在Pokemon過表達［7］。本研究采用免疫組織化學法檢測Pokemon蛋白表達率為78%，正常胃黏膜組織表達率為45%，提示胃癌組織中存在Pokemon蛋白過度表達。Lee等［8］研究表明，Pokemon的痘病毒鋅指結構域可與核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）-p65的Rel同源結構域發生反應，這種分子間的反應能增加細胞核NF-κB的穩定性，使NF-κB更長時間維持于核內。而NF-κB的異常核內激活與惡性腫瘤的發生及轉移密切相關［9］。淋巴結轉移是胃癌轉移的重要途徑，亦是影響胃癌患者預后的重要因素。本研究發現有淋巴結轉移組的胃癌組織中Pokemon蛋白表達率為87.5%，無淋巴結轉移組的為40.0%，提示Pokemon過表達與胃癌淋巴結轉移有密切關系。因此，推斷Pokemon可能增加了細胞核內NF-κB的表達水平并維持其穩定性，使NF-κB作用其靶基因，從而通過相關機制促使胃癌發生淋巴結轉移。

p14ARF功能失活可導致多種腫瘤發生［10］。胃癌組織p14ARF基因通常會發生變異，導致p14ARFmRNA及其蛋白無表達，從而加速細胞通過G1→S和G2→M調控點，使細胞呈無限制方式增殖生長，最終導致胃癌發生和發展［2］。本研究結果顯示，胃癌組織p14ARF蛋白表達率為42%，正常胃黏膜組織為90%，證實p14ARF蛋白缺失是導致胃癌的發生的原因之一。本研究還發現，有淋巴結轉移組的胃癌組織中p14ARF蛋白表達率為37.5%，無淋巴結轉移組為80.0%。p14ARF蛋白表達率，隨著分化程度的降低、浸潤程度的加深和臨床分期的升高而降低。這些可能與腫瘤抑制蛋白p14ARF參與了癌基因誘導的p53失活，過表達的癌基因能使p14ARF蛋白表達水平下調有關。

在腫瘤轉化過程中，p14ARF和p53的失活與原癌基因的過表達有協同作用［11］。本研究發現在細胞核Pokemon蛋白高表達的39例胃癌中同時有27例細胞核p14ARF蛋白低表達；在細胞核Pokemon蛋白低表達的11例胃癌中同時有9例細胞核p14ARF蛋白高表達，顯示胃癌組織中Pokemon蛋白表達與p14ARF蛋白表達呈明顯負相關。已有研究［12］發現，在ARF激動劑中存在數個Pokemon結合位點及數個轉錄調節物，可以調控ARF激動劑，從轉錄水平抑制了ARF的產生，使細胞內抑制機制缺陷，細胞增殖失控，導致腫瘤發生。設想如果有外源分子能夠拮抗或消除Pokemon的作用，則ARF可以發揮正常功能，從而消除癌變傾向。因此，能夠抑制Pokemon的藥物可能成為一種強有力的抗癌劑。（本文圖見封二）

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（本文編輯：趙麗潔）

EXPRESSIONS OF PROTEIN POKEMON AND p14ARFIN GASTRIC CARCINOMA TISSUES AND THEIR SIGNIFICANCE IN CLINICAL BIOLOGICAL BEHAVIOUR

JIA Nan1，LIU Yueping2，LIYong1*
（1.The Third Department of Surgery，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China；
2.Department of Pathology，the Fourth Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050011，China）

ObjectiveTo explore the relationship of the clinical biological behaviour and the expressions of Pokemon protein and p14ARFprotein in gastric carcinoma tissues.MethodsThe expressions of Pokemon and p14ARFproteins in specimens resected from 50 gastric carcinoma tissues and 20 adjacent noncancerous gastric tissue were detected by immunohistochemicalmethod.The correlations between the expression of Pokemon and p14ARFand the clinical histopathologic characters were retrospectively analyzed，including patientsˊsex and age，tumor location and size，gross type，differentiation degree，infiltration depth，lymph nodemetastasis，and clinical stage，etc.ResultsThe expressions of both Pokemon protein and p14ARFwere located in cellular nucleus in gastric carcinoma and normal gastric mucosa which showed buffy granulation in positive staining cellular nucleus.The expression rates of Pokemon in gastric carcinoma and adjacent noncancerousgastric tissuewere 78%and 45%，respectively，in which the difference was statistically significant（P＜0.05）.The expression rates of p14ARFprotein ingastric carcinoma and adjacent noncancerous gastric tissue were 42%and 90%，respectively.The difference also was statistically significant（P＜0.05）.②Pokemon protein expression rates of gastric carcinoma tissue were 87.5%and 40%in the presence and absence of lymph nodemetastasis，which was significantly different（P＜0.05）；Pokemon protein expressions were increased with the increases in tumor size，depth of invasion，and clinical stage.③The expression rates of p14ARFprotein were 37.5% and 80%in gastric carcinoma tissues with and without lymph node metastasis，and the latter was significantly higher than the former（P＜0.05）.p14ARFprotein expressions were decreased with the decrease in the degree of tumor differentiation and increases in the depth of invasion and clinical stage.④There was a significant negative correlation between the positive nuclear Pokemon expression and the positive nuclear p14ARFexpression（P＜0.05）.ConclusionPokemon overexpression and p14ARFlow expression in gastric carcinoma tissues can indicate the extent of clinical biological behaviour，such as the carcinogenesis，development，invasion，and metastasis of gastric carcinoma.

stomach neoplasms；pokemon protein；tumor suppressor protein p14ARF

R735.2

A

1007-3205（2012）03-0263-05

2011-08-01；

2012-02-29

賈楠（1981-），男，河北石家莊人，河北醫科大學第四醫院醫師，醫學碩士，從事胃腸腫瘤診治研究。

*通訊作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.03.006