低劑量X線照射對誘導大鼠骨髓間充質干細胞成骨分化的影響

劉洪鵬

傳統觀點一直認為電離輻射是對生物機體有害的，即使是很小的照射劑量也會對生物體造成損傷。并且隨著照射劑量的增加其造成的損傷也呈線性增加，即所謂的線性無閾理論(linear no threshold，LNT)。但近年來有研究表明低劑量照射(Low dose irradiation)對機體可能產生有益的作用。對低劑量電離輻射的生物學效應成為國內外放射醫學界研究的熱點。

骨髓間充質干細胞(BMSCs)是一類具有多分化潛能的前體細胞，在應激條件下可向不同成體細胞方向分化。Sabine Francois等認為LDI后損傷部位的組織修復可能與照射促使骨髓間充質干細胞“歸巢”、即向損傷部位趨化有關。本實驗以BMSCs作為實驗對象，在對其進行LDI照射后，檢測照射對其成骨潛能的影響，以期能夠從細胞水平部分解釋LDI促進大鼠骨折后骨痂礦化的機理。

1 材料與方法

1.1 一般資料 間充質干細胞(BMSCs)的提取取4周齡清潔級SD大鼠，頸椎脫臼處死，無菌條件下分離出雙側股骨，以取磷酸鹽緩沖液(PBS)對骨髓腔反復沖洗并吹打混勻獲取細胞懸液。收集細胞懸液并將其轉移入15 ml離心管中1000 r/min，離心5 min。棄上清液，加入含10% 胎牛血清的α-MEM培養液重懸，以1×106/cm2密度接種于25 cm2的培養瓶中，置于37℃、體積分數為0.05的CO2飽和濕度的培養箱中培養。于接種第24小時半量換液，待細胞貼壁后可全量換液。以后各每3 d全量換液1次。

1.2 分組及X線照射處理 細胞分為6組，分別為0 gy(假照射組)、25 mGy、50 mGy、75 mGy、100 mGy、1 gy(高劑量照射組)。每組設兩個培養板，每塊培養板設4個復孔。

1.3 成骨誘導 照射后更換含有10%胎牛血清、地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸的DMEM成骨誘導培養液。調整細胞濃度至1×104/ml，接種于24孔細胞培養板，每孔加培養基2 ml。同步化培養24 h，待細胞貼壁后，給予不同劑量X線照射處理。每3 d換液一次，持續誘導培養14 d。

1.4 RT-PCR法檢測成骨相關基因 由Genebank查出COL-1、OPG、BGP三種基因的堿基序列，根據引物設計原則選擇相應的堿基片段，并分別設計上下游引物。三種基因引物序列分別為

COL-1上游引物:5'-GATGCCAATGTGGTTCGTG-3'

下游引物:5'-TTCTTGCGGCTGCCCTCT-5'

OPG上游引物:5'-GGAGCAGAAGACATTGAA-3'

下游引物:5'-TGGACCTGGTTACCTATC-3'

BGP上游引物:5'-GCCCTCACACTCCTCGCCCTAT-3'

下游引物:5'-GCTCCAGGGGATCCGGGTAG-3'

內參GADPH上游引物:5'-TGCGTGACATTAAGGAGAAG-3'

下游引物:5'-CTGCATCCTGTCGGCAATG-3'

以Trizol裂解細胞，提取細胞內的RNA，以如上引物逆轉錄制得cDNA并進行PCR擴增，各組分別吸取6 μl PCR產物與標準100bpDNAmarker在1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓220 V，電泳時間30 min。紫外光下拍照后以全自動凝膠成像分析系統進行相對積分光密度分析，并與內參照物GADPH的光密度比較。

圖1 RT-PCR檢測不同劑量X線照射后成骨相關基因的表達情況

2.2 RT-PCR檢測成骨相關基因結果 RT-PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示如圖1。結果顯示經低劑量X線照射后，成骨相關基因COL-1、OPG、BGP較之假照射組相比，表達均有增強，其中以75 mGy與100 mGy照射組增強最為顯著，差異有統計學意義(P＜0.05);而在1 Gy高劑量X線照射后，成骨相關基因COL-1、OPG、BGP較假照射組相比表達均有減弱，差異有統計學意義(P＜0.05)。提示低劑量的X線照射在誘導BMSCs向成骨細胞分化的過程中可促進相關成骨基因的表達，增強BMSCs的成骨分化潛能，而高劑量X線照射則會對BMSCs的成骨分化有抑制作用(表1)。

表1 不同劑量X線照射后成骨相關基因的表達(n=8，)

表1 不同劑量X線照射后成骨相關基因的表達(n=8，)

注:與0 Gy組相比，P＜0.05

0 Gy 25 mGy 50 mGy 75 mGy 100 mGy 1000 mGy OPG 1.43±0.096 1.54±0.123 1.68±0.131* 1.73±0.049* 1.72±0.061* 1.37±0.037*COL-1 1.53±0.044 1.60±0.074 1.78±0.089* 1.85±0.118* 1.71±0.126* 1.37±0.049*BGP 1.01±0.038 1.21±0.057 1.25±0.072* 1.32±0.042* 1.31±0.051* 0.71±0.021*

3 討論

骨髓間充質干細胞作為成骨細胞的前體細胞，參與骨折后的愈合過程。因此，我們認為低劑量電離輻射促進BMSCs向成骨細胞方向分化可能是其促進骨痂礦化的機制之一。

我們通過RT-PCR法檢測了三種成骨基因:COL-1(Collagen I，Ⅰ型膠原)、OPG(osteoprotegerin，骨保護素)以及BGP(bone gla protein，骨鈣素)。三種基因均對骨折的愈合和成骨細胞的礦化有重要作用。

COL-1的合成和分泌是骨組織形成的前提條件，其合成和分泌的增加將對成骨細胞的礦化有促進作用，且在成骨分化的早期即有表達［1］，有研究報道COL-1的缺乏會導致成骨不全甚至骨折［2，3］。

OPG主要由骨組織中的成骨細胞產生［4］。其具有增加骨密度和抑制破骨細胞分化的作用，同時是是促進成骨細胞分化、成熟的重要細胞因子［5］。有研究表明將敲除小鼠OPG基因后，可導致嚴重的骨質疏松癥［6］。

BGP又名骨γ-羧谷氨酸包含蛋白，由成骨細胞合成和分泌，并且不受骨吸收因素的影響，含量比較穩定，通過對BGP基因的檢測，可以了解成骨細胞的活動狀態，從而可以反映誘導的BMSCs向成骨分化的能力。

本實驗中，結果證實在接受低劑量X線照射后，誘導分化的BMSCs表達COL-1、OPG、BGP的量均有明顯增加，以75 mGy與100 mGy組最為顯著，相關深層機制的研究有待于進一步探究。但可以肯定的是LDI具有促進骨髓間充質干細胞成骨分化潛能的作用，LDI的興奮性效應是醫學界的重大發現，在不久的將來有望應用于臨床，用于治療骨折延遲愈合和骨不連等。

［1］ Pochampally RR，Horwiitz EM，et al.Correction of a minerralezation defect by overexpression of wild-type cDNA for COL1A1 in marrow stromal cells(MSCs)from a patient with osteogenesis imperfecta:a strategy for rescuing mutations that produce dominantnegative protein defects.Gene Ther，2005，12:1119-1125.

［2］ Rauch F，Glorieux FH.Osteogenesis imperfecta.Lancet，2004，363:1377-1385.

［3］ Sakkers R，Kok D，Engelbert R，et al.Skelet al et al.Skelet al effects and functional outcome with olpadronate in children with osteogenesis imperfecta:a 2-year randomised placebo-controlled study.Lancet，2004，363:1427-1431.

［4］ Simon WS，Lacey DL，et al.Osteoprotegerin:a novel seccreted protein involved in the regulation of bone density.Cell，1997，89:309-319.

［5］ Lacey DL，Timms E，Tan HL，et al.Osteoprotegerin(OPG)ligand is a cytokine that regulate osteoclast differentiation and activation.Cell，1998，93:165-176.

［6］ Bucay N，Sarisi I，Dunstan CR，et al.Osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoprosis and arterial calfinication.Gene Dev，1998，12:1260-1268.