低劑量X線照射對誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響

劉洪鵬

傳統(tǒng)觀點一直認為電離輻射是對生物機體有害的，即使是很小的照射劑量也會對生物體造成損傷。并且隨著照射劑量的增加其造成的損傷也呈線性增加，即所謂的線性無閾理論(linear no threshold，LNT)。但近年來有研究表明低劑量照射(Low dose irradiation)對機體可能產(chǎn)生有益的作用。對低劑量電離輻射的生物學效應成為國內(nèi)外放射醫(yī)學界研究的熱點。

骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)是一類具有多分化潛能的前體細胞，在應激條件下可向不同成體細胞方向分化。Sabine Francois等認為LDI后損傷部位的組織修復可能與照射促使骨髓間充質(zhì)干細胞“歸巢”、即向損傷部位趨化有關(guān)。本實驗以BMSCs作為實驗對象，在對其進行LDI照射后，檢測照射對其成骨潛能的影響，以期能夠從細胞水平部分解釋LDI促進大鼠骨折后骨痂礦化的機理。

1 材料與方法

1.1 一般資料 間充質(zhì)干細胞(BMSCs)的提取取4周齡清潔級SD大鼠，頸椎脫臼處死，無菌條件下分離出雙側(cè)股骨，以取磷酸鹽緩沖液(PBS)對骨髓腔反復沖洗并吹打混勻獲取細胞懸液。收集細胞懸液并將其轉(zhuǎn)移入15 ml離心管中1000 r/min，離心5 min。棄上清液，加入含10% 胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液重懸，以1×106/cm2密度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于接種第24小時半量換液，待細胞貼壁后可全量換液。以后各每3 d全量換液1次。

1.2 分組及X線照射處理 細胞分為6組，分別為0 gy(假照射組)、25 mGy、50 mGy、75 mGy、100 mGy、1 gy(高劑量照射組)。每組設(shè)兩個培養(yǎng)板，每塊培養(yǎng)板設(shè)4個復孔。

1.3 成骨誘導 照射后更換含有10%胎牛血清、地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸的DMEM成骨誘導培養(yǎng)液。調(diào)整細胞濃度至1×104/ml，接種于24孔細胞培養(yǎng)板，每孔加培養(yǎng)基2 ml。同步化培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，給予不同劑量X線照射處理。每3 d換液一次，持續(xù)誘導培養(yǎng)14 d。

1.4 RT-PCR法檢測成骨相關(guān)基因 由Genebank查出COL-1、OPG、BGP三種基因的堿基序列，根據(jù)引物設(shè)計原則選擇相應的堿基片段，并分別設(shè)計上下游引物。三種基因引物序列分別為

COL-1上游引物:5'-GATGCCAATGTGGTTCGTG-3'

下游引物:5'-TTCTTGCGGCTGCCCTCT-5'

OPG上游引物:5'-GGAGCAGAAGACATTGAA-3'

下游引物:5'-TGGACCTGGTTACCTATC-3'

BGP上游引物:5'-GCCCTCACACTCCTCGCCCTAT-3'

下游引物:5'-GCTCCAGGGGATCCGGGTAG-3'

內(nèi)參GADPH上游引物:5'-TGCGTGACATTAAGGAGAAG-3'

下游引物:5'-CTGCATCCTGTCGGCAATG-3'

以Trizol裂解細胞，提取細胞內(nèi)的RNA，以如上引物逆轉(zhuǎn)錄制得cDNA并進行PCR擴增，各組分別吸取6 μl PCR產(chǎn)物與標準100bpDNAmarker在1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓220 V，電泳時間30 min。紫外光下拍照后以全自動凝膠成像分析系統(tǒng)進行相對積分光密度分析，并與內(nèi)參照物GADPH的光密度比較。

圖1 RT-PCR檢測不同劑量X線照射后成骨相關(guān)基因的表達情況

2.2 RT-PCR檢測成骨相關(guān)基因結(jié)果 RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示如圖1。結(jié)果顯示經(jīng)低劑量X線照射后，成骨相關(guān)基因COL-1、OPG、BGP較之假照射組相比，表達均有增強，其中以75 mGy與100 mGy照射組增強最為顯著，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而在1 Gy高劑量X線照射后，成骨相關(guān)基因COL-1、OPG、BGP較假照射組相比表達均有減弱，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。提示低劑量的X線照射在誘導BMSCs向成骨細胞分化的過程中可促進相關(guān)成骨基因的表達，增強BMSCs的成骨分化潛能，而高劑量X線照射則會對BMSCs的成骨分化有抑制作用(表1)。

表1 不同劑量X線照射后成骨相關(guān)基因的表達(n=8，)

表1 不同劑量X線照射后成骨相關(guān)基因的表達(n=8，)

注:與0 Gy組相比，P＜0.05

0 Gy 25 mGy 50 mGy 75 mGy 100 mGy 1000 mGy OPG 1.43±0.096 1.54±0.123 1.68±0.131* 1.73±0.049* 1.72±0.061* 1.37±0.037*COL-1 1.53±0.044 1.60±0.074 1.78±0.089* 1.85±0.118* 1.71±0.126* 1.37±0.049*BGP 1.01±0.038 1.21±0.057 1.25±0.072* 1.32±0.042* 1.31±0.051* 0.71±0.021*

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細胞作為成骨細胞的前體細胞，參與骨折后的愈合過程。因此，我們認為低劑量電離輻射促進BMSCs向成骨細胞方向分化可能是其促進骨痂礦化的機制之一。

我們通過RT-PCR法檢測了三種成骨基因:COL-1(Collagen I，Ⅰ型膠原)、OPG(osteoprotegerin，骨保護素)以及BGP(bone gla protein，骨鈣素)。三種基因均對骨折的愈合和成骨細胞的礦化有重要作用。

COL-1的合成和分泌是骨組織形成的前提條件，其合成和分泌的增加將對成骨細胞的礦化有促進作用，且在成骨分化的早期即有表達［1］，有研究報道COL-1的缺乏會導致成骨不全甚至骨折［2，3］。

OPG主要由骨組織中的成骨細胞產(chǎn)生［4］。其具有增加骨密度和抑制破骨細胞分化的作用，同時是是促進成骨細胞分化、成熟的重要細胞因子［5］。有研究表明將敲除小鼠OPG基因后，可導致嚴重的骨質(zhì)疏松癥［6］。

BGP又名骨γ-羧谷氨酸包含蛋白，由成骨細胞合成和分泌，并且不受骨吸收因素的影響，含量比較穩(wěn)定，通過對BGP基因的檢測，可以了解成骨細胞的活動狀態(tài)，從而可以反映誘導的BMSCs向成骨分化的能力。

本實驗中，結(jié)果證實在接受低劑量X線照射后，誘導分化的BMSCs表達COL-1、OPG、BGP的量均有明顯增加，以75 mGy與100 mGy組最為顯著，相關(guān)深層機制的研究有待于進一步探究。但可以肯定的是LDI具有促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化潛能的作用，LDI的興奮性效應是醫(yī)學界的重大發(fā)現(xiàn)，在不久的將來有望應用于臨床，用于治療骨折延遲愈合和骨不連等。

［1］ Pochampally RR，Horwiitz EM，et al.Correction of a minerralezation defect by overexpression of wild-type cDNA for COL1A1 in marrow stromal cells(MSCs)from a patient with osteogenesis imperfecta:a strategy for rescuing mutations that produce dominantnegative protein defects.Gene Ther，2005，12:1119-1125.

［2］ Rauch F，Glorieux FH.Osteogenesis imperfecta.Lancet，2004，363:1377-1385.

［3］ Sakkers R，Kok D，Engelbert R，et al.Skelet al et al.Skelet al effects and functional outcome with olpadronate in children with osteogenesis imperfecta:a 2-year randomised placebo-controlled study.Lancet，2004，363:1427-1431.

［4］ Simon WS，Lacey DL，et al.Osteoprotegerin:a novel seccreted protein involved in the regulation of bone density.Cell，1997，89:309-319.

［5］ Lacey DL，Timms E，Tan HL，et al.Osteoprotegerin(OPG)ligand is a cytokine that regulate osteoclast differentiation and activation.Cell，1998，93:165-176.

［6］ Bucay N，Sarisi I，Dunstan CR，et al.Osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoprosis and arterial calfinication.Gene Dev，1998，12:1260-1268.