非發酵菌的耐藥性及產超廣譜β-內酰胺酶及碳青霉烯酶分析

李 銳 龔莉瓊 田素飛

1.懷化醫專附屬懷化市第三人民醫院檢驗科，湖南懷化 418000；2.中國醫科大學附屬第一醫院檢驗科，遼寧沈陽 110001

非發酵菌是指一群不發酵糖類或僅以氧化形式利用葡萄糖、需氧或兼性厭氧的無芽胞革蘭陰性桿菌，包括不動桿菌屬、假單胞菌屬、伯克霍爾德菌屬等在內的9個屬近百種細菌。近年來，由于各種廣譜抗菌藥物、化學治療、放射治療、侵襲性操作的開展及免疫抑制劑的應用，使非發酵菌已成為機會感染與醫院感染的主要致病菌，尤其是銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌。并且這些菌株往往表現為多重耐藥，給臨床治療造成了極大的困難。產β-內酰胺酶（ESBLs）是革蘭陰性桿菌最重要的耐藥機制，其中以產ESBLs和碳青霉烯酶最具有臨床意義。本研究對2011年6月～2012年6月懷化市第三人民醫院156株非發酵菌進行耐藥性及產ESBLs和碳青霉烯酶分析，旨在為臨床合理使用抗菌藥物、降低醫院感染發生率、預防和控制非發酵菌感染提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集懷化市第三人民醫院2011年6月～2012年6月各臨床科室送檢的微生物標本中分離的非發酵菌156株，同一患者無重復標本。

1.2 主要試劑與儀器

美羅培南（MEM）、亞胺培南（IPM）、哌拉西林/他唑巴坦（PIP/TZ）、 頭孢吡肟 （FEP）、 頭孢他啶 （CAZ）、 頭孢噻肟（CTX）、頭孢哌酮/舒巴坦（CFP/SU）、阿米卡星（AK）、環丙沙星（CIP）、氨曲南（ATM）、慶大霉素（GM）、妥布霉素（TPM）、復方新諾明（SXT）、氨芐西林（AMP）、左旋氧氟沙星（LEV）、頭孢噻肟/棒酸（CD03，30/10 μg）、頭孢他啶/棒酸（CD02，30/10μg），均為英國OXO ID公司產品；M-H培養基干粉，由杭州天和微生物試劑有限公司提供；VITEK-2全自動微生物分析儀及與其配套的GN革蘭陰性桿菌鑒定卡和YST GN13藥敏試驗卡，由法國生物梅里埃公司提供。

1.3 質控菌株

大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853、肺炎克雷伯ATCC 700603、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1706，均購自衛生部臨床檢驗中心。

1.4 細菌的分離培養、鑒定

按《全國臨床檢驗操作規程》（第3版）進行細菌的分離培養和常規鑒定，采用Vitek-2微生物分析系統進行鑒定。

1.5 藥物敏感性試驗

根據美國臨床實驗室標準化委員會（CLSL/NCCLS 2010版）標準采用紙片擴散法（K-B法）檢測常見非發酵菌對15種抗生素（IPM、MEM、PIP/TZ、FEP、CAZ）、CTX、CFP/SU、AK、CIP、ATM、GM、TPM、SXT、AMP、LEV）的耐藥性。 將大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853作為藥敏試驗質控菌株。結果判斷參照NCCLS 2010年判斷標準。

1.6 β-內酰胺酶檢測

初篩試驗（CAZ≤22 mm，CTX ≤27 mm，ATM ≤27 mm，FEP≤22 mm）為陽性的銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌按NCCLS確認試驗檢測 （紙片增效試驗），即CTX （30μg），CTX/CLV （CD03，30/10 μg） 與 CAZ （30 μg），CAZ/CLV（CD02，30/10μg），任意一對含酶抑制劑紙片抑菌圈直徑增加≥5 mm為ESBLs陽性。具體步驟參照《全國臨床檢驗操作規程》（第3版）。質控菌株選用ESBLs陽性的肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

1.7 碳青霉烯酶檢測

將耐IPM或MEM的銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌分別采用改良Hodge試驗（MHT，指示菌為大腸埃希菌ATCC 25922）、銅綠假單胞菌改良Hodge試驗（PAE-MHT，指示菌為肺炎克雷伯菌ATCC 700603）兩種方法進行碳青霉烯酶檢測。陽性質控菌株為肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705，陰性質控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706。用生理鹽水配制0.5麥氏標準的指示菌，再用鹽水1∶1稀釋，按常規紙片擴散法程序接種 MHA，使平板干燥 3～10 min，使用 10μL接種環挑取血瓊脂平板過夜生長的3～5個試驗菌落或質控菌株，從紙片邊緣向外劃直線，劃線長20～25 mm，在平板表面放置美羅培南紙片，置空氣環境，（35±2）℃培養 16～20 h。 如果在抑菌圈與試驗菌株或質控菌株劃線交叉處出現增強生長現象，則表示碳青霉烯酶陽性，如無增強現象則碳青霉烯酶陰性。

1.8 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，采用Kappa檢驗評價兩種改良Hodge試驗的一致性，當Kappa＞0.7時，兩者一致性較好，當0.4≤Kappa≤0.7時，兩者一致性一般，當Kappa＜0.4時，兩者一致性較差。

2 結果

2.1 非發酵菌的種類及分布

156株非發酵菌主要為：鮑曼不動桿菌 （76/156）、銅綠假單胞菌 （48/156）、嗜麥芽窄食單胞菌 （17/156）及其他（15/156）（表 1）。 這些標本主要來自于 ICU（103/156）、呼吸內科（15/156）、神經外科（16/156）、神經內科（8/156）及其他科室（14/156）。76.2%的菌株來自痰液、呼吸道導管、支氣管灌洗液等呼吸道標本，其余依次為膽汁引流液、穿刺液、創面分泌物、尿液、膿液、其他標本。

表1 156株非發酵菌的分布

2.2 主要非發酵菌的耐藥譜

鮑曼不動桿菌對CLSI推薦的15種抗菌藥物耐藥率為28.9%～100.0%，耐藥率較低的抗菌藥物是頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、左旋氟氧沙星；銅綠假單胞菌耐藥率為31.6%～93.2%，耐藥率較低的抗菌藥物是哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星；嗜麥芽窄食單胞菌耐藥率為21.2%～100.0%，對亞胺培南耐藥率最高為100.0%，同時對頭孢吡肟也表現出高度耐藥達95.7%，耐藥率較低的抗菌藥物是頭孢哌酮/舒巴坦、環丙沙星、復方新諾明、左旋氧氟沙星。其他非發酵菌株因分離株數過少，不具代表性，故沒有給與耐藥譜分析。見表2。

表2 主要非發酵菌對抗菌藥物的耐藥率（%）

2.3 產β-內酰胺酶細菌的檢出率

76株鮑曼不動桿菌中初篩陽性58株，經確認試驗檢測產ESBLs 21株，檢出率為27.6%；48株銅綠假單胞菌中初篩陽性41株，經確認試驗檢測產ESBLs 18株，檢出率為37.5%；ESBLs總檢出率為31.45% 。

2.4 產碳青霉烯酶細菌的檢出率及兩種改良Hodge試驗的比較

82株碳青霉烯類耐藥非發酵菌中，鮑曼不動桿菌52株，銅綠假單胞菌30株。兩種改良Hodge試驗檢測鮑曼不動桿菌碳青霉烯酶的一致性較好，Kappa值為0.86（表3）；兩種改良Hodge試驗檢測銅綠假單胞菌碳青霉烯酶的一致性一般，Kappa值為 0.58（表 4）。

表3 兩種改良Hodge試驗檢測鮑曼不動桿菌產碳青霉烯酶情況（株）

表4 兩種改良Hodge試驗檢測銅綠假單胞菌產碳青霉烯酶情況（株）

3 討論

在分離的156株非發酵菌中，鮑曼不動桿菌居于首位（48.72%），其次是銅綠假單胞菌（30.77%）和嗜麥芽窄食單胞菌（10.90%），結果與國內學者鞠曉紅等[1]的報道一致。本研究收集的非發酵菌主要來自ICU，與任利珍等[2]報道一致。原因可能為ICU患者年齡偏大，不但多存在較嚴重的基礎疾病，并且常接受侵入性檢測和介入治療，住院期間長時期使用多種廣譜抗菌藥物，使得耐藥率高的非發酵菌定植生長。全國醫院感染監測網歷年統計均表明，呼吸系統感染為各部位醫院感染之首。本研究顯示，呼吸道感染占76.2%，與朱道等[3]的報道一致。

對多種抗菌藥物天然耐藥以及使用抗菌藥物后又發生獲得性耐藥，是非發酵菌耐藥性的一個重要特點[4]，如產生ESBLs，和氨基糖苷類修飾物、外膜蛋白改變、DNA旋轉酶和拓撲異構酶Ⅳ基因突變引發耐藥[5]，同時整合子-基因盒系統在銅綠假單胞菌的耐藥中發揮重要作用[6]。鮑曼不動桿菌被稱為革蘭陰性的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，攜帶多種耐藥基因，對多種抗菌藥物具有天然耐藥性。本研究顯示，鮑曼不動桿菌對頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、左旋氟氧沙星耐藥率為28.9%、58.8%、56.0%，對其余抗菌藥物耐藥率均大于65.0%，臨床可根據藥敏結果選用適合的抗菌藥，其中，對亞胺培南和美羅培南的耐藥率高達68.6%，意味著其對現有多種抗菌藥物耐藥，提示臨床應嚴格掌握碳青酶烯類抗菌藥物的適應證。銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥率達62.4%，哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星對銅綠假單胞菌具較好抗菌活性，耐藥率分別為36.3%、31.6%、37.5%、36.0%，與王志勤等[7]的報道一致。第三、四代頭孢菌素對革蘭陰性桿菌具較強抗菌活性，本研究顯示，銅綠假單胞菌對其的耐藥性較高，這給臨床抗感染構成嚴重威脅，并易導致抗感染治療的失敗。本研究顯示，嗜麥芽窄食單胞菌對亞胺培南天然耐藥，頭孢哌酮/舒巴坦、環丙沙星、復方新諾明、左旋氧氟沙星對其具有較強的抗菌活性，耐藥率分別為36.3%、36.4%、21.2%、32.8%，其對頭孢類抗生素的耐藥率較高，均大于60%。

銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌產ESBLs陽性率分別占37.5%、27.6%，與張德忠等[8]的報道一致。銅綠假單胞菌產ESBLs株對亞胺培南、美羅培南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率較低，對其余抗菌藥物的耐藥率較高；鮑氏不動桿菌產ESBLs株對亞胺培南、美羅培南、頭孢吡肟、阿米卡星耐藥率較低，對其余抗菌藥物的耐藥率較高。

碳青霉烯酶的臨床實驗室檢測對于確定適當的治療方案和實施感染控制措施具有重要意義。MHT已被廣泛應用于碳青霉烯酶的常規實驗室檢查，由于其操作簡單，CLSI推薦用MHT試驗來檢測腸桿菌科是否產生碳青霉烯酶，但是該方法并不能檢測出產碳青霉烯酶的銅綠假單胞菌感染。Pasteran等[9]研究利用標準化的MHT來檢測腸桿菌時發現作為質控菌的ATCC25922被大部分的待測菌抑制，結果顯示為不確定。Lee等[10]的報道中也出現了類似的結果。當改用肺炎克雷伯菌ATCC700603作為指示菌時，可以避免這種抑制生長現象的出現，并且具有高重復性和最佳的靈敏度和特異度，因此，將此命名為銅綠假單胞菌改良Hodge試驗（PAEMHT）。鑒于此，本實驗分別采用MHT和PAE-MHT兩種方法檢測鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌碳青霉烯酶的產生，并且比較其檢測能力。檢測鮑曼不動桿菌，兩種方法的一致性較好；檢測銅綠假單胞菌時，兩種方法一致性較差，PAEMHT優于MHT，并且PAE-MHT沒有出現不確定的結果。提示用肺炎克雷伯菌ATCC 700603作為質控菌的PAE-MHT試驗能常規檢測出碳青霉烯酶陽性的銅綠假單胞菌。

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[3]朱道，朱海平，王麗英.臨床標本中常見非發酵菌分布及耐藥性分析[J].檢驗醫學與臨床，2012，9（24）：1720-1724.

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