胃癌組織中RUNX3和突變型P53蛋白的表達及臨床意義

李華

人類runt相關轉錄因子3(human runt-related transcription factor 3，RUNX3)是runt家族中新近受到廣泛關注的基因，是哺乳動物RUNT家族進化的基礎［1］，定位于人染色體1號短臂1p36 上。轉化生長因子(transforming growth factor beta，TGF-β)是許多細胞的有效抑制因子其信號紊亂將導致許多腫瘤的發生。研究發現，RUNX3蛋白可指導TGF-β信號轉到過程中激活的Smad復合物從細胞質內轉入細胞核內特定靶位點，加強Smad復合物與靶位點的結合強度并激活靶基因，從而對細胞的分化、細胞周期調控、凋亡和惡性轉化起作用［2］。在眾多的腫瘤中均發現了染色體1p36的異常［3－5］，作為一種新的候選腫瘤抑制基因，RUNX3受到廣泛關注。為進一步明確RUNX3基因在胃癌發生、發展中的作用，本研究通過檢測60例胃癌新鮮組織和正常黏膜組織(癌旁5cm)中的抑癌基因P53的蛋白及RUNX3基因的表達，探討其兩者之間在胃癌發生、發展中的相關性，為胃癌的早期診斷提供有效簡便的監測手段。

1 資料與方法

1.1 一般資料 60例胃癌及對照黏膜組織標本取自我院2008年11月至2009年12月的胃鏡活檢標本，男34例，女26例;年齡31～68歲，平均年齡47歲;其中胃癌標本術后淋巴結病理證實，淋巴結轉移33例。所有胃癌標本均經術后病理證實。所有受檢對象受檢前均未經過放化療等治療。RUNX3兔單克隆抗體購自Abcom公司，P53小鼠單克隆抗體購自Lab Vision公司。免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 于電子胃鏡直視下取胃組織粘膜標本5～7塊，所有標本均經10%中性甲醛固定48 h，經脫水、浸蠟包埋處理后，行機器連續切片，分別行常規HE染色，P53免疫組化染色、RUNX3免疫組化染色。

1.2.2 結果判斷:突變型P53主要在癌細胞核表達，呈現為深淺不一的棕黃色顆粒。RUNX3染色主要在細胞核及細胞漿表達，呈深淺不一的棕黃色顆粒。以已知乳癌標本作為陽性對照，以PBS作為陰性對照。陽性細胞計算:每張切片隨機觀察5個高倍視野，每個視野計數100個細胞中的陽性細胞數，取均值，以百分數表示細胞陽性數，陽性細胞數小于10%為陰性，10%～50%為陽性，51%～100%為強陽性，后兩者均記作陽性。

1.3 統計學分析 計數資料采用χ2檢驗，相關性檢驗，P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 突變型P53蛋白在胃癌組織及對照標本中的表達 突變型P53蛋白在胃癌組織中的陽性表達率為75.00%，在對照標本中的表達率為35.00%，突變型P53蛋白在胃癌組織中的陽性表達率明顯增高(χ2=9.025，P=0.0027)。見表1。

2.2 RUNX3蛋白在胃癌組織及對照標本中的表達 RUNX3蛋白在胃癌組織中的陽性表達率為45.00%，在對照標本中的表達率為85.00%，RUNX3蛋白在胃癌組織中的陽性表達率明顯降低(χ2=8.777，P=0.0031)。見表1。

2.3 RUNX3的表達與胃癌臨床病理因素的關系 RUNX3和突變型P53的表達與胃癌的分化程度及淋巴結轉移有關(P＜0.01)，而與性別、腫瘤大小無關(P ＞0.05)。見表2。

圖1 胃正常粘膜(HE×100)

圖2 胃癌組織黏膜中RUNX3表達(SP×200)

圖3 胃黏膜組織中RUNX3表達(SP×200)

表1 RUNX3與P53蛋白在胃黏膜和胃癌黏膜組織中表達比較

表2 RUNX3 mRNA表達與其臨床病理特征的關系

3 討論

Runt家族包括3個基因其家族成員均具有含123個氨基酸Runt Domain(RD區域)，RUNX蛋白與 Smad2、Smad3形成復合物傳遞TGF-β/activin信號，都與人類疾病的發生密切相關。RUNX3含有2個高度保守的CpG島，其中一個大的CpG島位于RUNX3基因啟動子P2周圍，其內富含有GC啟動子的特征控制RUNX3基因的轉錄［1］。目前研究發現消化道腫瘤如胃癌、膽管癌、胰腺癌和肝細胞癌中均有染色體1p36異常［6，7］。而P53基因屬于一種抑癌基因，定位于17號染色體。野生型p53基因通過抑制細胞過度增殖，啟動DNA損傷修復機制，誘導凋亡，協調細胞凋亡與增殖速度，修復損傷的DNA或通過凋亡清除DNA異常的細胞，從而防止細胞的異常蓄積和惡性轉化。而突變型的P53則失去了其抑癌基因的作用從而在胃癌組織中過度表達。

本研究結果表明胃癌中突變型P53的表達率明顯高于正常組織，而RUNX3的表達率明顯降低，與此同時，突變型P53基因表達在低分化和伴有淋巴結轉移組中明顯高于中高分化和未轉移組，而RUNX3基因卻與之相反。因此，近年來部分學者更傾向于RUNX3基因是一種抑癌基因，在胃癌發生中起重要作用［8，9］。

在胃癌組織標本中RUNX3和P53的表達成負相關。RUNX3蛋白作為TGF-β信號通路下游的一個轉錄因子其內部的RD區域β亞單位可與Runx蛋白結合，阻止了runt區域的泛素化且穩定Runx蛋白，增加其與DNA的親和力［10］。本研究結果發現胃癌組織中RUNX3蛋白的表達低于正常粘膜組織，說明在胃癌的發生發展過程中可能由于RUNX3基因的失活導致了其編碼的蛋白不能夠表達，影響其功能的發揮［11，12］，而野生型的P53突變使其失去了DNA損傷修復功能，兩者共同作用下從而導致胃癌發生。

RUNX3在胃癌中失活而致的異常表達和野生型P53的突變在胃癌的發生、發展中起一定作用，RUNX3基因作為胃癌的一種新的抑癌基因，對其參與胃癌發生、發展的具體機制的進一步研究必將對胃癌的臨床早期診斷和治療帶來新的啟示。

1 Bangsow C，Rubins N，Glusman G，et al.The RUNX3 gene-sequence，structure and regulated expression.Gene，2001，279:221-232.

2 Zaidi SK，Sullivan AJ，van Wijnen AJ，et al.Integration of Runx and Smad regulatory signals at transcriptionally active subnuclear sites.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99:8048-8053.

3 Tokumaru Y，Nomoto S，Jeronimo C，et al.Biallelic inactivation of the RIZI gene in human colon cancer.Oncogene，2003，22:6954-6958.

4 Kang YK，Kim YI，Kim WH.Allelotype analysis of intrahepatic cholangiocarcinoma.Mod Patho，2000，13:627-631.

5 Fang W，Piao Z，Simon D，et al.Mapping of aminimal deleted region in human hepatocellular carcinoma to 1p36.13-p36.23 and mutational analysis of the RIZ(PRDM2)gene localized to the region.Genes Chromosomes Cancer，2000，28:269-275.

6 Ito Y.Molecular basis of tissue-specific gene expression mediated by the runt domain transcription factor PERP2/CBF.Genes Cells，1999，4:685-696.

7 Warren AJ，Bravo J，Williams RL，et al.Structural basis for the heterodimeric interaction between the acute leukaemia-associated transcription factors AML1 and CBFbeta.EMBO J，2000，19:3004-3015.

8 Li QL，Ito K，Sakakura C，et al.Causal relationship between the loss of RUNX3 expression and gastric cancer.Cell，2002，109:113-124.

9 Waki T，Tamura G，Sato M，et al.Promoter methylation status of DAP-kinase and RUNX3 genes in neoplastic and non-neoplastic gastric epithelia.Cancer Sci，2003，94:360-364.

10 Miyazono K，Suzuki H，Imamura T，et al.Regulation of TGF-beta signaling and its roles in p rogression of tumors.Cancer Sci，2003，94:230-234.

11 Kim TY，Lee HJ，Hwang KS，et al.Methylation of RUNX3 in various types of human cancers and pre-malignant stages of gastric carcinoma.Lab Invest，2004，84:479-484.

12 Levanon D，Brenner O，Otto F，et al.RUNX3 knockouts and stomach cancer.EMBO Rep，2003，4:560-564.