伊貝沙坦對胰島素抵抗大鼠腎間質中TGF-β1表達的影響

劉冰 王利軍 牛凱 史亞男

在腎臟病患者中，轉化生長因子-β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)可調節炎性反應，促進細胞外基質(ECM)的合成和沉積，減少ECM的降解，腎間質纖維化主要是由于細胞外基質產生與降解失衡以及成纖維細胞過度增生所致［1］。伊貝沙坦對胰島素抵抗腎組織中TGF-β1表達的影響與腎間質纖維的關系和機制尚不清楚。為此進行了相關研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物的來源與分組 8周齡雄性SD大鼠32只，由河北醫科大學實驗動物中心提供。將大鼠隨機分為對照組，模型組，伊貝沙坦50mg/kg、100mg/kg干預組，每組8只。模型組以高脂高糖飼料喂養，對照組一直予以基礎飼料喂養直至實驗結束。干預組中伊貝沙坦(法國Sanofi公司提供)溶于蒸餾水按大鼠體重灌胃，飼料喂養與模型組相同。喂養12周后處死動物，觀察結果。

1.2 收縮壓(SBP)的測定 在每周日早晨8∶00～10∶00將大鼠在箱中預熱38℃，10min后，用尾袖法測量大鼠尾動脈血壓。

1.3 空腹血糖(FBG)、胰島素(FINS)測定 喂養12周后，大鼠禁食12 h過夜，血糖儀檢測空腹血糖(FBG);酶聯免疫法測定血清胰島素(FINS);計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR)，公式為(Ins×FBG)/22.5，統計時取自然對數使其符合正態性，再進行統計。

1.4 組織病理學檢查 SD大鼠處死后立即取腎臟組織液氮冷凍，－70℃保存。用Trizol RNA提取試劑盒提取總RNA，RTPCR按照逆轉錄試劑盒說明書進行。TGF-β1 PCR反應條件:95℃預變性 5min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，32個循環，最后72℃保溫10min。GAPDHPCR反應條件:95℃預變性 5min，94℃變性 30 s，51℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，30個循環。產物經112%瓊脂糖電泳和凝膠成像系統分析，計算與內參照β-actin吸光度A比值。取10 μl的RT-PCR產物，加入2 μl的DNA上樣緩沖液，混勻后加樣。以1×TPE作為電泳液，V/cm恒壓恒流電泳，電泳1 h，停止電泳，多功能凝膠分析儀下觀察結果。

1.5 統計學分析應用SPSS 11.5統計軟件，計量資料以表示，在進行方差齊性檢驗后，組間比較用單因素方差分(ANOVA)，P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組大鼠的血壓變化 模型組收縮壓較對照組、伊貝沙坦50mg/kg干預組高，伊貝沙坦100mg/kg組血壓明顯低于于其他3組，差異有統計學意義(P ＜0.01)。見圖1。

圖1 喂養12周4組大鼠血壓變化

2.2 FBG、FINS、ISI和 TGF-β1mRNA 表達的變化 實驗結束時4組動物FBG之間，差異無統計學意義(P＞0.05)。4組模型組胰島素水平顯著高于其他3組，差異有統計學意義(P＜0.05)。4組 HOMA-IR模型組明顯高于其他組(P ＜0.01)。伊貝沙坦可抑制大鼠腎組織TGF-β1基因表達，與模型組比較有明顯統計學差異，伊貝沙坦100組大鼠腎組織TGF-β1基因表達與伊貝沙坦50組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 4 組 FBG、FINS、HOMA-IR 和 TGF-β1/β-actin的比較 n=8，

表1 4 組 FBG、FINS、HOMA-IR 和 TGF-β1/β-actin的比較 n=8，

注:與模型組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01;與伊貝沙坦50 組比較，△P ＜0.05

-actin對照組 6.02 ±0.38 39.22 ±9.25* 0.78 ±0.16#組別 FBG(mmol/L) FINS(mU/ml) HOMA-IR TGF-β1/β 0.62 ±0.03模型組 6.05 ±0.26 51.45 ±10.25 1.89 ±0.29 1.75 ±0.06*伊貝沙坦 50 組 6.35 ±0.86 35.24 ±9.24* 1.22 ±0.21# 1.35 ±0.05#伊貝沙坦 100 組 6.26 ±0.76 31.23 ±9.96* 1.05 ±0.22# 1.03 ±0.04#△

3 討論

具有致纖維化作用因子及血管活性物質，TGF-β是其中最主要的，TGF-β1是調節細胞增殖和分化的一種多功能細胞因子，特別在調控細胞外基質(ECM)聚積中起中心調節作用。TGF-β1主要通過自分泌及旁分泌發揮生物學作用，它通過控制細胞周期G1期向S期轉化來抑制細胞增生，誘導細胞肥大;同時它能增加腎小球上皮細胞、系膜細胞、腎近曲小管上皮細胞和成纖維細胞ECM蛋白分子的合成，抑制基質降解蛋白酶如膠原酶的合成，阻止ECM的降解，結果使ECM成分升高，減少ECM的降解，腎間質纖維化主要是由于細胞外基質產生與降解失衡以及成纖維細胞過度增生所致。

近十年許多大型臨床試驗表明了阻斷RAS系統可以延緩腎功能衰竭的發展。伊貝沙坦是一個對AT1受體有特異性拮抗作用，通過選擇性地阻斷AngⅡ與AT1受體的結合，抑制血管收縮和醛固酮的釋放，產生降壓作用。伊貝沙坦不抑制血管緊張素轉換酶、腎素、其它激素受體，也不抑制與血壓調節和鈉平衡有關的離子通道，但對胰島素抵抗的影響尚不十分清楚。本研究表明高脂高糖喂養使大鼠的胰島素抵抗指數升高，伊貝沙坦組大鼠胰島素抵抗指數較高脂高糖喂養組明顯降低(P＜0.01)，與正常大鼠組接近。說明模型組大鼠發生胰島素抵抗，而伊貝沙坦可改善胰島素抵抗。

本研究顯示持續或間斷的高脂高糖環境，可促使腎小球系膜細胞肥大，TGF-β1mRNA和蛋白的表達量增高，TGF-β1是目前公認的最重要的致纖維化生長因子，誘導多種細胞外基質成分mRNA表達增加［3］。TGF-β1基因具有多態性，而且這種多態性能影響其轉錄，并與多種因素引起的TGF-β1水平特征性升高密切相關。可是伊貝沙坦劑量不同對TGF-β1 mRNA的表達不能達到正常水平，伊貝沙坦大劑量對大鼠腎組織TGF-β1mRNA表達的影響明顯優于小劑量伊貝沙坦。伊貝沙坦還能減弱因高脂高糖喂養而造成TGF-β的表達，減少ECM沉積［4，5］。在腎病治療中，需要高于常規ARB劑量的數倍用藥才能充分抑制TGF-β1表達，獲得更多的腎臟保護效果。為臨床腎病用藥開辟新思路。

1 Kimura Y，Okuda H，Okuda T，et al.Studies on the activities of tannins and related compounds，X.Effects of caffeetannins and related compounds onarachidonate metabolism in human polymorphonuclear leukocytes.J Nat Prod，2007，50:392-399.

2 李光偉.當前胰島素敏感性評估及胰島素抵抗研究中的某些誤區.中華內科雜志，1998，37:81-83.

3 房輝，徐剛，于德民，等.TGF-β1和ECM與糖尿病腎病關系的實驗研究.中國糖尿病雜志，2000:227-230.

4 Schnaper HW，Hayashida T，Hubchak SC，et al.TGF-beta signal transduction and mesangial cell fibrogenesis.Am J Physiol Renal Physiol.2003，284:F243-252.

5 Klahr S，Morrissey J.Obstructive nephropathy and renal fibrosis.Am J Physiol Renal Physiol，2002，283:F861-75.