達英-35對PCO模型大鼠中卵巢組織cx43表達的影響

戴碎平 王永紅

（山西醫科大學第二臨床醫學院婦產科，山西 太原 030001）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種以高雄激素血癥，胰島素抵抗，稀發排卵，和卵巢多囊樣改變的在育齡婦女中比較常見的臨床綜合征。發病率在育齡期婦女中為5%～10%。持續性無排卵，不孕，雄激素過多和胰島素抵抗是其重要特征，是生育期婦女月經紊亂最常見的原因，其病因至今尚未闡明。連紅梅等[1-2]研究表明cx43在多囊卵巢大鼠卵巢中有表達。我們前期研究證實，來曲唑誘導的多囊卵巢模型大鼠是成功的，可以降低多囊卵巢模型大鼠的高雄激素血癥。本研究在此基礎上進一步探討達英-35在多囊卵巢模型大鼠卵巢組織cx43的表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：6周齡SD雌性大鼠，體質量約150g，清潔級別：清潔級，河北醫科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK （冀）2008-1-003，合格證編號1109112。

1.2 藥物

來曲唑：購買于江蘇恒瑞醫藥公司，化學式：1-[雙（4-氰基苯基）甲基]-1，2，4-三氮唑），生產批號是H19991001；達英-35：購買于拜耳醫藥公司，批號201000003；睪酮測定試劑盒（直接化學發光法）：產品編號：07207660（110782）。黃體生成素測定試劑盒（直接化學發光法）：產品編號0175629 （110752）；卵泡刺激素測定試劑盒（直接化學發光法）：產品編號04912924（110755）；生產廠家：SIEMNS HEALTHCARE DIANOSTICS INC；冰王脫毛膏-上海冰王生物科技發展有限公司。

1.3 PCO大鼠模型的建立及分組

應用Kafali[3]造模法建立動物模型，6周齡SD雌性大鼠36只，選至少有4d的規律動情周期，完全隨機分為3組，即正常對照組、PCOS模型組和達英-35組，每組均為12只。每只大鼠均給以顆粒性鼠料和水，光照12h/d，每日取陰道分泌物，采用瑞士染色，監測動情周期。正常對照組用灌胃針灌服1%羧甲基纖維素（CMC），其余各組均灌胃服用來曲唑1mg/（kg·d）溶于1%CMC中，連續灌服21d之后，各組行剪尾采血，檢測血清FSH、LH、T、水平符合PCOS大鼠模型標準者進行實驗研究，其中模型組和達英-35組有兩只由于操作不當死亡2只。剩余34只。

1.4 實驗方法

達英-35（炔雌醇環丙孕酮）組為自9周齡起，按人與大鼠公斤體質量折算系數給藥，將藥物溶于1% CMC（1mL/100g）給藥，1次/d，連續3周；同時給予正常對照組和模型組大鼠同體積1% CMC （1mL/100g），1次/d，連續21d。到12周齡整時，禁飲食12h，應用6%水合氯醛（1mL/100g）行腹腔內麻醉，心臟取血5mL，3000r／min離心，10min分離血清，-20℃保存；取出一側卵巢后置于福爾馬林中固定3d。另一側卵巢放于-70℃凍存備用作Western blotting。

1.5 血清性激素測定

應用化學發光方法測定睪酮，促卵泡激素、促黃體生成激素、以觀察內分泌改變。試劑盒由SIEMNS HEALTHCARE DIANOSTICS INC公司提供，質控符合要求。

1.6 石蠟包埋切片

用石蠟包埋卵巢組織，以4μm厚度連續切片四次。石蠟塊的制備的步驟如下：首先，將卵巢組織固定24h，從固定液中取出卵巢組織，修剪脂肪組織，最大限度的暴露卵巢組織，放入小銅盒入用來水沖洗12h，放入70%酒精過夜。其次，酒精脫水由低濃度到高濃度：組織放入70%酒精1h→80%酒精1h→90%酒精1h→95%酒精Ⅰ1h→95%酒精Ⅱ1h→100%酒精Ⅰ30min→100%酒精Ⅱ30min→酒精∶二甲苯（1∶1）30min。再次，分別放入二甲苯Ⅰ1h透明→二甲苯Ⅱ30min透明。最后，蠟缸Ⅰ浸蠟1h后，放入蠟缸Ⅱ浸蠟1h，再放入蠟缸Ⅲ浸蠟1h。

1.7 免疫組織化學染色法

采用免疫組織化學染色的方法，觀察卵巢組織中cx43的表達，cx43一抗為兔抗鼠多克隆抗體，一抗稀釋比例為1∶50-200由美國bioworld公司提供。封閉液：5%BSA 3mL，用于組織切片的封閉。二抗：聚合HRP標記抗兔IgG（武漢博士德生物工程有限公司）。圖像灰度值分析系統進行灰度值測定。免疫組化染色步驟：①石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS（pH7.4）沖洗3次，每次3min（3×3′）。②根據每一種抗體的要求，對組織抗原進行相應的修復。③如果有必要，每張切片加1滴（試劑A）室溫下孵育10min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性。PBS（pH7.4），每2min，沖洗3次。④除去PBS液，每張切片加1滴或50μL的第一抗體，4℃過夜，PBS（pH7.4），每2min，沖洗3次。⑤滴加聚合HRP標記抗兔IgG，37度孵育30min。⑥DAB顯色。⑦蘇木精輕度復染，脫水，透明，封片，觀察。

1.8 統計學處理

2 結 果

2.1 PCOS動物模型

2.1.1 動情周期的變化：陰道涂片并行瑞氏染色后，可見模型組在應用來曲唑21d后動情周期失去規律性變化，提示無排卵。對照組仍保持規律的動情周期變化。

2.1.2 卵巢組織學改變：HE染色鏡檢可見模型組膜細胞層增厚；有較多早期發育的小卵泡和閉鎖卵泡；囊狀擴張卵泡明顯增加。顆粒細胞層減少至2～3層，卵泡內卵母細胞或放射冠消失，黃體數量明顯下降且伴有不完全的黃素化，間質細胞明顯增生，未見排卵前卵泡及排卵跡象。染色鏡檢結果見圖1。

2.1.3 與正常對照組比較：模型組大鼠血清LH、T、FSH水平明顯升高（P＜0.05），其余兩組性激素水平差異無顯著性（P＞0.05）。

圖1 染色鏡檢結果

2.1.4 與模型組比較：達英-35組、正常對照組大鼠血清LH、T、FSH水平明顯降低（P＜0.05）。

2.1.5 與達英-35組比較：正常對照組、大鼠血清性激素無顯著性差異（P＞0.05）。見表1

表1 藥物干預后各組大鼠性激素水平的比較

2.1.6 cx43在卵巢組織中的表達：光鏡下可見cx43主要在卵巢顆粒細胞中表達，在模型組表達水平顯著低于正常對照組（P＜0.05）。達英-35組表達水平顯著高于模型組組（P＜0.05）。見表2。

表2 三組Cx43表達水平灰度值比較(±s)

表2 三組Cx43表達水平灰度值比較(±s)

注：模型組與正常對照組比較：P＜0.05；與達英-35組與正常對照組比較：P＞0.05

組別 n cx43正常對照組 12 149.590± 9.25 PCO模型組 11 98.1945± 6.51達英-35組 11 143.794±9.81 F 65.842 P 0.000

3 討 論

多囊卵巢綜合征是育齡婦女中最常見的內分泌紊亂的一種臨床綜合征。發病機制包括內容廣泛，包括神經、內分泌、代謝系統和卵巢局部的調控因素。其病因至今尚未闡明，成為目前婦科內分泌領域內最復雜的研究熱點。我們前期研究[3]已經證實了來曲唑誘導的多囊卵巢模型大鼠是成功的，本研究在此基礎上進一步探討達英-35對多囊卵巢模型大鼠卵巢組織cx43的表達的影響。

3.1 cx43與PCO模型大鼠卵巢組織中的表達水平及意義

cx43是卵巢組織間隙連接中表達最多的連接蛋白，由基因Gjal編碼cx43蛋白。連接蛋白是間隙連接的基本結構單位和功能基礎。有兩個基因位點位于人類卵巢組織中：定位于6號染色體上是功能基因，定位于5號染色體上是假基因。編碼人類cx43的基因位于6q22.3，全長約3.0kb[4]。cx基因家族是保守的，不同的cx具有共同的結構特征。cx43分子質量為43kD，其蛋白質肽鏈由382個氨基酸構成，其中1～242位氨基酸構成管道部分，243～382位構成細胞質尾部[5]。cx43主要表達在成熟卵泡卵丘上的顆粒細胞間。Gershon等[6]研究顯示cx43的下調會影響卵子產生，卵泡的發育，排卵功能，導致排卵障礙，影響早期胚胎的發育。Carabatsos等[7]研究表明，cx43影響卵泡發育可能有以下幾個方面：它促進正常卵泡的發育，同時使得顆粒細胞能夠增多分層和正常增殖。在選擇卵泡和促進卵泡凋亡方面發揮有益作用。在排卵、黃體形成、分化和退化中也發揮有利作用。在卵巢卵泡生理過程中發揮也重要作用。Gilchrist等[8]在研究中觀察到，細胞間縫隙連接GJC在減數分裂中起重要作用：如促進卵母細胞新陳代謝、卵母細胞的細胞質成熟及卵母細胞發育。

本實驗研究結果顯示，本實驗研究結果顯示，與正常對照組相比較，在模型組中卵巢顆粒細胞中cx43的表達水平降低，cx43表達降低是PCOS發生發展的一個病理基礎。在卵巢顆粒細胞中表達的cx43水平異常下降，以自分泌或旁分泌的形式作用于鄰近顆粒細胞，也可以作用于鄰近卵泡細胞和周圍原始卵泡的形成，導致其激素分泌活動水平的異常變化，這可能是形成了PCOS的明顯的高雄激素血癥和卵巢呈多囊性改變等重要基礎。

3.2 達英-35組對多囊卵巢模型大鼠卵巢組織中cx43表達的影響

達英-35不僅可以逆轉PCOS模型大鼠卵巢組織形態學表現，進一步從細胞因子水平探討可能通過達英-35恢復排卵。實驗結果顯示，達英-35組具有升高cx43水平、改善多囊卵巢征象、恢復排卵的作用。本實驗研究通過觀察達英-35對多囊卵巢模型大鼠的卵巢組織中cx43的表達情況，揭示達英-35對改善多囊卵巢模型大鼠的卵巢結構和功能發揮著作用。經達英-35組治療后，大鼠卵巢組織中cx43增多。由此可見，達英-35組可以改善高雄激素血癥，是各種激素和因子相互促進和制約，調節下丘腦一垂體一卵巢軸的功能得以恢復，使卵巢內環境發生改變，卵巢的局部調控恢復正常，有效的改善PCOS卵泡發育和成熟障礙，顆粒細胞增殖和分層障礙，卵母細胞發育不成熟或者缺失，稀發排卵。cx43在正常卵巢組織廣泛表達而又被廣泛研究的連接蛋白，深入研究與之相關的蛋白，更有利于我們深刻地闡明該分子的功能，也有助于理解因cx43調控導常而引起的一些相關疾病分子機制，也為我們今后探索新藥物提供了理論依據。

[1] 連紅梅,賈莉婷,張展.間隙連接蛋白Cx43和Cx37在多囊卵巢綜合征大鼠卵巢中的表達及意義[J].中國婦幼保健,2008,28(34):4622-4623.

[2] Kafali H,Iriadam M,Ozardl I.Letrozole-Induced PolycysticOvaries in the rat: A New Model for Cystic Ovarian Disease[J].Archives of Med Res,2004,35(10):103.

[3] 王永紅,王洪麗.炔雌醇環丙孕酮對多囊卵巢綜合征大鼠卵巢組織形態學的研究[J].中國藥物與臨床,2011,11(12):1968-1970.

[4] 王永紅,王洪麗.復方甘芍貼劑對多囊卵巢綜合征大鼠模型的研究[J].中國中西醫結合雜志,2012,32(3):437-440.

[5] Tennissen BE,Bierhuizen MF.Ttansiptional control of myocardial connexins[J].Cardiovasc Res,2004,62(2):246-255.

[6] Yancey SB,John SA,Lal R,et a1.The 43-kD polypeptide of heart gap junctions:immunoloealization,topology,and functional domains[J].J Cell Biol,1989,108(6):2241-2254.

[7] Carabatsos MJ,Sellitto C,Goodenough DA,et al.Ocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence[J].Dev Biol,2000,2(26):167-179.

[8] Gilchrist RB,Lane M,Thompson JG.Oocyte-secreted factors:regulators of cumulus cell function and oocyte quality[J].Hum Reprod Update,2008,14(2): 159-177.