珠子肝泰對實驗性慢性肝損傷的影響

張 穎 劉曉麗

（1 鐵嶺衛生職業學院，遼寧 鐵嶺 112008；2 鐵嶺市中心醫院，遼寧 鐵嶺 112000）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑：珠子肝泰，批號11050614，由昆明制藥股份有限公司提供，取膠囊內容物（每g含原生藥4.03g），加蒸餾水配成所需濃度的藥液。四氯化碳（CCl4），批號1007162，廣東汕頭市西隴化工廠。加蒸餾水碾勻溶解配成所需濃度的藥液備用。酶譜測定：ALT，AST，ALP（南京建成生物工程研究所）；MAO（北京鼎國生物工程公司提供的試劑盒）測定。統計數據處理：計量資料均以（±s）表示進行兩兩均數的比較，使用SPSS13.0分析統計。

1.1.2 動物：Wistar大鼠，雄性，體質量150～230g，由中國醫科大學實驗動物部提供。

1.2 方法

1.2.1 動物處理：實驗動物（除外正常對照組） 均飼以高脂大鼠飼料（10%豬油+79%玉米粉+1%膽固醇），以上材料由中國醫科大學實驗動物部提供。飲水為清水。喂養4周后，給所有大鼠（除外正常對照組），皮下注射40% CCl4-橄欖油溶液1mL/kg，后每4日注射1次。2個月后，隨機將大鼠分為6組，正常對照組、模型對照組、陽性對照組（肌苷片）、珠子肝泰低、中、高劑量組，每組10只。正常組大鼠飼以正常飲食；模型：對照組予以灌胃蒸餾水10mL/kg，1次/日；陽性對照組予以灌胃肌苷片10mg/kg，1次/日；治療組低劑量組灌胃珠子肝泰供試液5mL/kg，1次/日；治療組中劑量組灌胃珠子肝泰供試液10mL/kg，1次/日；治療組高劑量組灌胃珠子肝泰供試液20mL/kg，1次/日。各實驗動物組（正常組除外）給藥期間，繼續每隔3日注射1次四氯化碳（CCl4）。

1.2.2 檢驗方法：給藥2個月后，到期眼眶靜脈叢取血，分離血清進行肝臟功能檢查，測定ALT、AST、CHE及A/G，將大鼠處死后剖取肝臟稱重，計算肝臟的重量指數。大鼠肝臟切片進行肝臟組織膠原纖維定量檢查：從大鼠肝臟固定部位取肝組織標本，浸泡于10%甲醛溶液固定2h后，逐級遞度酒精脫水，石蠟包埋，常規切片，HE染色后，光鏡下觀察。另外常規切片一份，采用Masson染色法做肝Masson染色。將所有各檢大鼠肝Masson染色切片在Mias22000型圖形圖像分析儀進行膠原纖維定量分析（測量肝組織Masson染色切片上5個視野肝膠原纖維的含量）。剩余大鼠肝組織制成勻漿，測定CHE，MAO等酶學指標。

2 結 果

2.1 病理組織學檢查

光鏡觀察組織形態。

2.1.1 HE染色觀察：鏡下見以中央靜脈為中心，肝細胞向四周呈放射狀排列且吻合成網，肝血竇亦吻合成網，可見結締組織及肝小葉構成的匯管區，肝細胞呈多邊形，較大，胞質嗜酸。模型對照組大鼠肝組織正常結構破壞，并有較明顯的纖維形成，肝細胞明顯腫脹變性，肝索排列紊亂，脂肪變多見。中央靜脈周圍可見肝細胞少量壞死，伴有單核細胞、中性粒細胞等炎性細胞侵潤。匯管區結締組織增生變寬。各藥物治療組與模型對照組比較，肝組織結構無明顯破壞，肝細胞脂肪變性不明顯。珠子肝泰大劑量組肝組織破壞程度顯著減輕，肝細胞壞死減少，無明顯匯管區結締組織增生。小劑量組程度輕微減輕，肝細胞壞死減輕，匯管區結締組織增生。

2.1.2 膠原纖維染色觀察：模型對照組大鼠肝臟內膠原纖維大量增生，積聚形成間隔和條索，自匯管區向肝小葉內延伸，形成多個假小葉。各藥物治療組膠原纖維輕度增生，未見假小葉形成，肝正常結構破壞較輕微。

2.2 肝損傷酶活性變化：珠子肝泰能顯著性降低血清ALT酶，升高血清和肝勻漿CHE，顯著性高于模型組（P＜0.01），ALT、AST、ALP、MAO活性均較模型組明顯降低（P＜0.01），見表1。

2.3 對四氯化碳所致慢性肝損傷大鼠ALP與自由基的影響：四氯化碳并不導致膽汁瘀積，在ALT升高時ALP并不急劇升高，但GSH與MAO顯著升高，珠子肝泰大劑量組ALP值與正常組相似，對ALP卻有明顯降低作用（P＜0.01），對MAO有顯著清除作用（表2）。

表1 珠子肝泰合劑對四氯化碳所致慢性肝損傷大鼠肝功能和肝臟重量指數的影響（±s）

表1 珠子肝泰合劑對四氯化碳所致慢性肝損傷大鼠肝功能和肝臟重量指數的影響（±s）

注：與肝損傷模型組比較▲P＜0.05，★P＜0.01

組別 劑量 ALT AST TP ALB A/G 肝臟指數[g/(kg·d)](u/L) (u/L) (g/L) (g/L) (g/100g體質量)正常對照 34.11±3.21 110.72±17.09 84.89±8.16 43.88±2.89 1.74±0.18★ 3.528±0.343模型對照 66.48±17.30 156.11±13.27 97.93±2.66 45.50±2.72 0.92±0.25▲ 4.190±0.403珠子肝泰 15 42.95±17.44▲ 125.69±21.90 90.57±4.13 45.33±3.41 1.39±0.41 3.284±0.545▲珠子肝泰 10 44.14±15.18▲ 133.37±14.16▲ 90.88±5.40▲ 45.29±3.79 1.07±0.27 3.465±0.343珠子肝泰 5 50.96±10.69▲ 156.70±13.71▲ 95.53±7.17▲ 45.27±3.10▲ 1.27±0.27 4.176±0.685★肌苷片 1.0 47.39±7.39★ 158.35±13.15★ 96.07±6.12★ 45.93±3.88★ 1.31±0.27▲ 3.705±0.814

表2 珠子肝泰合劑對四氯化碳所致慢性肝損傷大鼠自由基的影響影響（±s）

表2 珠子肝泰合劑對四氯化碳所致慢性肝損傷大鼠自由基的影響影響（±s）

注：與肝損傷模型組比較▲P＜0.05，★P＜0.01

組別 劑量 CHE MAO GSH[g/(kg·d)](u/L) (nmol/L) (mg/L)正常對照 181.2±41.0 122.5±29.1 66.0±13.9模型對照 262.6±26.2 156.9±23.4 90.0±23.1珠子肝泰 15 303.9±63.6▲ 120.2±19.9 70.0±13.5珠子肝泰 10 292.2±58.9▲ 123.6±14.7▲ 80.0±9.3珠子肝泰 5 281.6±51.5▲ 129.4±15.5▲ 90.0±10.2肌苷片 1.0 275.9±43.6★ 112.5±17.6★ 60.0±11.4

3 討 論

臨床實踐證實，乙型肝炎進展為肝硬化等重癥肝病不能單純依靠抗病毒治療來阻斷。研究發現抗肝纖維化治療對本病患者的預后有重要的地位，它對延緩或阻止慢乙型肝炎向肝硬化等重癥肝病發展起著不可替代的作用[1]。

四氯化碳（CCl4）是一種經典的肝臟毒物，它往往通過復合因素造成大鼠肝損傷及肝硬化模型，是由營養不良和化學中毒造成的肝細胞損傷，肝細胞脂肪變性、炎癥、壞死、網狀支架塌陷，膠原纖維結締組織增生，進而發展為肝硬變[2]。四氯化碳致慢性肝損傷的主要機制是產生三氯甲基自由基，引起肝細胞內脂質過氧化以及直接的膜溶解作用，促使肝細胞壞死，最終肝功能衰竭。攝入大量高脂低蛋白膳食，對慢性肝損傷的形成及惡化起了輔助作用[3]。

珠子肝泰是一種純中藥制劑，是以苦味葉下珠的主要成分并輔以青葉膽、黃芪和甘草制成的復方制劑。具有明顯的抗HBV作用且對肝損傷有一定的防護作用，能提高機體的細胞免疫功能，改善體液免疫功能，特別是通過提高紅細胞免疫黏附功能，從而可促進HBV的進一步清除[4]。

本實驗中病理組織學檢查結果提示，模型對照組大鼠肝細胞變性、壞死、纖維組織增生明顯著于藥物治療組，藥物治療組大鼠均未出現肝硬化。其中珠子肝泰大劑量組的療效優于陽性對照組及其他各組。專家認為，肝內轉氨酶含量約為血中的100倍，因此若肝細胞有1%壞死，可使血清中酶活力增加1倍；此外肝內轉氨酶濃度約較血清中高1000～5000倍左右，肝細胞膜通透性增加時，細胞內轉氨酶也可順濃度梯度差而進入血液中，因此血清轉氨酶（ALT、AST）測定是判斷肝細胞損害的敏感指標，在一定程度上，血清轉氨酶升高反映了肝細胞的損害程度。ALP的活性主要反映了膽汁淤積[5]。在膠原纖維形成過程中，MAO參與膠原成熟最后階段的架橋形成，因而MAO活性與肝纖維化程度有關[6]。本實驗以ALT、AST、ALP、MAO 4種酶聯合檢測，反映肝臟各方面的病理變化。本實驗結果顯示，模型對照組酶活性均較各治療組顯著升高。結果與病理組織學結果相一致。統計學分析認為珠子肝泰對CCl4所致大鼠慢性肝損傷有保護作用。具體原因可能是通過改善肝臟微循環，抗肝纖維化，改善肝臟病理，抗脂質過氧化，繼而取得抗慢性肝損傷的效果。能有效地降低CCl4所致慢性肝損傷大鼠血清與肝勻漿ALT，升高血清和肝勻漿中CHE，說明受損的肝細胞得以恢復，GSH是GSH-PX與GSH-ST的底物，并受GGT的調節[7-9]。張明娟等的研究也證實，珠子肝泰對HBeAg有滅活作用，能抑制細胞分泌HBcAg，HBeAg，對急性肝損傷有顯著的保護作用，并能抑制腫瘤細胞的生長，具有調節免疫、保肝和抑制病毒多種作用[10]。當肝功能衰竭時谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）與谷胱甘肽-S轉移酶（GSH-ST）的合成降低，GSH蓄積肝內解毒功能下降，珠子肝泰合劑使肝勻漿中GSH水平顯著下降，MAO減少，提示珠子肝泰使肝細胞得以保護和修復，間質細胞的解毒與清除功能加強，組織形態學表明肝細胞受損的程度低于模型組，肝組織修復增強，珠子肝泰這種作用可能是抑制氧自由基對細胞胞膜的損傷有關。CCl4可導致膽汁瘀積，珠子肝泰有消除瘀膽作用，組織病理學顯示肝組織內未見膽汁瘀積。珠子肝泰對四氯化碳所致高血清ALT有顯著的抑制作用，血清與肝勻漿CHE值明顯上升，MDA降低，但肌苷片對四氯化碳損傷的肝細胞內GSH蓄積仍未清除，提示GSH-PX合成受阻，說明前者的恢復還只是部分恢復。珠子肝泰組織形態學特征與生化結果有一致性，提示珠子肝泰對四氯化碳所致慢性肝損傷的作用優于肌苷片，珠子肝泰對四氯化碳的作用可能與抑制炎細胞浸潤，加強肝細胞器修復有關。珠子肝泰對免疫性肝損傷小鼠ALT與AST有顯著降低作用，微粒體內NO水平升高，另外，本實驗中病理組織學結果表明，珠子肝泰的療效優于肌苷片，且服用方便、起效快，未發現毒副作用，有較高的臨床應用價值。

[1]龍富立,邱華,陳月橋,等.丹參注射液聯合恩替卡韋治療慢性乙型肝炎肝纖維化57例臨床觀察[J].中醫藥導報,2011,17(8):16-17.

[2]程麗娟,陳曉農,劉青川,等.靈五顆粒對四氯化碳誘導大鼠慢性肝損傷的影響[J].醫藥導報,2011,30(7):16-17.

[3]王心童,王虹蛟,王強,等.抑肽酶對實驗性慢性肝損傷肝組織纖維化影響的研究[J].中國實驗診斷學,2011,15(12):2033-2034.

[4]劉建平.阿德福韋脂聯合珠子肝泰膠囊治療慢性乙型肝炎68例臨床觀察[J].臨床合理用藥,2011,3(11):48-49.

[5]楊波,吳元凱,陳忠誠,等.ALT、AST、TBil及PT變化趨勢與慢加急性乙型肝炎肝衰竭預后的關系[J].臨床肝膽雜志,2012,28(3):205-208.

[6]Ye WF,Zhong ZY.Clinic disease of hepatobiliary[M].Tianjin:Tianjin Science Press,1998:190.

[7]Shen GX,Zhou RL.Modern experimental technology in immunology[M].Wuhan:Hubei Science Press,1998: 261.

[8]Xu SY,Bian RL,Chen X.Themethod of pharmacological experiment[M].Beijing:People's Health Press,1994: 489.

[9]Wang GS.Studies on the role of nitric oxide and tumor necrosis factor in immunological liver injury in mice and effects of new anti-hepatitis compounds on the liver injury[J].Prog Physiol Sci,1996,27(1):17-18.

[10]張明娟,方娟,李志賢,等.珠子肝泰膠囊治療慢性乙型肝炎720例[J].陜西中醫,2006,27(11):1405-1406.