輕度認知障礙患者血小板中α、β－分泌酶基因表達水平及其臨床意義

何池忠 劉新通 王麗娟 張 雄 徐書雯 莫建偉 李東風

輕度認知障礙（mild cognitive impairment，MCI）是指介于正常老化和癡呆之間的一種過渡階段的認知障礙，是老年性癡呆（Alzheimer disease，AD）發生的高危人群。在美國 MCI的發病率為9.9‰老年人，進展為 AD的年發生率為6%～25%［1］，有學者認為作為正常老化向AD發展的過渡狀態，MCI是AD藥物干預的最佳時機。但目前臨床上尚缺乏一種敏感的客觀的檢測指標指導醫生對MCI進行準確的分型診斷及預后判定，一定程度上影響了AD早期干預的實施。α分泌酶（ADAM10）、β分泌酶（BACE1）是β淀粉樣前體蛋白（APP）的裂解酶，是影響Aβ產生的主要因素，可能在AD發病的早期機制中發揮重要作用［2］。本研究應用實時熒光定量PCR（FQ－PCR）及ELISA技術檢測了MCI患者外周血中的ADAM10、BACE1基因表達水平及Aβ42濃度，探討ADAM10、BACE1在MCI分型診斷及預后判定中的作用和意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 來自廣東省人民醫院神經內科及老年醫學研究所神經內科病房和門診2007年1月～2008年1月期間就診的MCI患者。符合Peterson等MCI診斷標準［3］，診斷采用MCI國際工作組修訂的MCI診斷程序。納入標準包括主訴有記憶減退，病程≧3個月；有記憶減退的客觀證據；簡易精神評定量表（MMSE）≥24分；臨床癡呆量表（CDR）0.5分；一般認知功能與日常生活能力保持正常；無癡呆。排除標準包括明確的癡呆、明確的腦卒中病史及其他可引起腦功能障礙的軀體和精神疾病。共28例，男13例，女15例，年齡52～81歲，平均年齡（67.74±7.40）歲，受教育年限3～15年，平均（9.12±3.75）年。

對照組設AD組和正常老年組。AD病例來源同MCI組。AD的診斷采用CCMD—Ⅲ—R有關AD的診斷標準，共28例，男16例，女12例，年齡57～84歲，平均年齡（69.17±8.14）歲，受教育年限4～13年，平均（8.05±3.44）年。正常老年組來源于本院體檢中心的正常老人，共21例，男10例，女11例，年齡59～79歲，平均年齡（68.09±5.22）歲，受教育年限7～17年，平均年齡（10.65±2.84）年。MCI組和AD組、正常老年組的年齡、受教育年限比較無明顯差異（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 血小板標本的采集 均抽晨靜脈血10 ml，2%EDTA抗凝，離心1 500 r／min×15 min，將上層的富血小板血漿轉移至塑料管中，離心3 500 r／min×5 min，分離上清并分別置于－20℃冰箱保存。

1.2.2 FQ－PCR 檢 測 ADAM10、BACE1 mRNA表達水平

1.2.2.1 引物設計與合成 利用 Primer premier 5.0軟件設計，由Invitrogen公司合成。ADAM10：5＇－ACAGTGCAGTCCAAGTCAAG－3＇（forward），5＇ACACGTACACTCCTCTAAGC 3＇（reverse），片段長244 bp。BACE1 5＇CATCCTTCCGCAGCAATACC3＇（forward），5＇TGCCGTCCTGAACTCATC GT3＇（reverse），片段長208 bp，內參照 GAPDH 5＇AGCCTCAAGATCATCAGC3＇（forward），5＇GAGT CCTTCCACGATACC3＇（reverse），片段長度96 bp。

1.2.2.2 總 RNA提取和cDNA合成 采用 Trizol試劑盒（Invitrogen），按說明書提取血小板中的總RNA，1.2%瓊脂糖電泳鑒定血小板中總RNA；使用Prime Script TM逆轉錄試劑盒（Takara）合成cDNA，反應體系共25μl，包括10×PCR buffer 2.5 μl，d NTP 1μl，dd H2O 18.15μl，Taq酶0.35μl，上游外引物（10 pmol／L）1μl，下游外引物（10 pmol／L）1μl，RNA模板：1μl。反應條件為95℃3 min，94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，共30個循環，72℃10 min終止反應，4℃保存。

1.2.2.3 制備標準曲線和樣本的FQ－PCR檢測將擴增的PCR產物進行核酸電泳，使用膠回收試劑盒（天根生化科技，北京）對目的條帶進行切膠回收純化；對回收純化的DNA測OD260及OD280，計算其濃度及純度，稀釋成106copies／ul作為標準曲線的第一個梯度；再將各標準樣品以10倍梯度倍比稀釋，共做5個梯度；實時檢測儀（ABI 7300）上擴增并檢測熒光；計算機自動根據閾循環（Cycle threshold，Ct）值與對應模板的拷貝數對數作圖，繪制標準曲線；樣本的檢測按照SYBR Green熒光定量PCR試劑盒（Takara）說明書進行；反應體系共20μl，包括SYBR Green Real time PCR Master Mix 9μl，dd H2O 6μl，上游內引物 F（10 pmol／μl）2μl，下游內引物 R（10 pmol／μl）2μl，cDNA 產物1μl。反應條件為95℃2 min，94℃15 s，60℃30 s，72℃35 s，共30個循環，在反應的第二步94℃末讀取熒光值，反應結束后進行融解曲線分析。

1.2.3 ELISA 檢測血漿中 Aβ42水平 ELISA 試劑盒由EHSY Lab（香港）贈送，按說明書操作：常溫下解凍血漿，加蛋白酶抑制劑AEBSF（Sigma）至1 mmol／L，以防止Aβ降解。取出已包被的酶聯板（96孔），設空白孔、標準孔、待測樣品孔，分別加標準品或樣品100μl，覆膜封存置室溫下2 h，棄液甩干，加Aβ42抗體反應液100μl，覆膜封存置37℃下孵育2 h，棄液甩干，加二抗反應液100μl，覆膜封存置室溫下2 h，棄液甩干，加底物及終止液，490 nm下讀取吸光度值。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 目的基因的定量曲線與熔解曲線分析

在FQ－PCR反應體系中每經過一個循環，收集一次熒光信號，從而得到一條熒光擴增曲線，同時給出熒光信號達到設定閾值時所經歷的循環數，即Ct值；Ct值與模板的起始拷貝數的對數呈線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小；通過計算ΔCt值確定目的基因的相對表達水平。ADAM10、BACE1的定量曲線見圖1、2。熔解曲線分析發現ADAM10、BACE1的PCR產物均呈較為銳利的單一峰（圖3、4），Tm分別為83.9℃和85.1℃，沒有其他雜峰出現。

圖1 ADAM10基因定量曲線

圖2 BACE1基因定量曲線

圖3 ADAM10基因熔解曲線

圖4 BACE1基因熔解曲線

2.2 血小板中ADAM10、BACE1基因的表達水平

每個樣品重復擴增3次取均值，ΔCt值由計算機軟件自動計算得出（表1）。AD、MCI組BACE1m RNA表達水平是正常老年組的4.51倍、2.22倍，有顯著性差異（F＝4.847，P＜0.05）。

表1 血小板中ADAM10、BACE1基因的表達水平（±s，ΔCt）

表1 血小板中ADAM10、BACE1基因的表達水平（±s，ΔCt）

注：與正常老年組比較，△P＜0.05；與 MCI組比較，▲P＜0.05

mRNA正常老年組 21 1.13±0.16 0.64±0.組別 n ADAM10 m RNA BACE1 22 AD組 28 211.61±0.11 2.89±0.20△▲MCI組 28 0.97±0.17 1.42±0.17△

2.3 血漿中Aβ42水平及相關性分析

MCI組、AD組及正常老年組的Aβ42水平中位數分別為250（90～680）ng／L、210（110～500）ng／L及160（75～630）ng／L，3組比較無明顯差異（F＝2.772，P＞0.05）。將 Aβ42值分別與 ADAM10ΔCt值、BACE1ΔCt值進行Spearman相關性分析顯示，Aβ42含量與ADAM10基因表達水平（r＝－0.1442，P＞0.05）及BACE1基因表達水平（r＝0.161 1，P＞0.05）均無關。

3 討 論

MCI不是一個疾病單元，而是一個異質性臨床綜合征，其臨床轉歸并不相同。最近在歐洲完成的一項多中心研究發現750例MCI患者經過至少2年的追蹤后，其中36%轉化為AD，8%轉化為血管性癡呆或其它類型的癡呆，52%病情保持穩定不轉化為癡呆，4%逆轉成正常［4］。Peterson也認為遺忘型MCI易轉化成AD，血管型MCI易轉化成血管性癡呆或其它類型的癡呆［3］。因此，臨床上迫切需要一種或幾種生物指標能夠作為MCI臨床分型、轉歸判定的客觀依據，以指導開展癡呆的早期干預。近些年來的研究提示MCI腦脊液中乙酰膽堿轉移酶水平、總tau含量、磷酸化tau含量、總tau／Aβ42／40比值、磷酸化tau／Aβ42／40比值、Aβ42／Aβ40比值、apoE基因型等均可能成為臨床候選指標［5，6］。也有研究者發現 MCI患者血漿中的 Aβ42、Aβ40水平、Aβ42／Aβ40比值、血小板中的BACE1活性及APP異構體比率等可能具有預后判定的價值，但由于重復性差或檢測復雜、費用昂貴等原因這些指標一直未能在臨床推廣［7，11，12］。本研究采用 FQ－PCR 技術檢測了MCI患者血小板中的ADAM10、BACE1的基因表達水平，發現AD、MCI患者BACE1mRNA表達水平是正常老人的4.51倍、2.22倍，且在AD中表達也高于MCI，這提示MCI血小板中BACE1mRNA的高表達可能具有臨床預測意義。這與目前的相關研究結論相一致［8，9］。Henrik等還發現 MCI患者血漿中BACE1活性與β淀粉樣前體蛋白（APP）的代謝產物s APPα、s APPβ、Aβ42、Aβ40水平有關［10］。本研究用ELISA法檢測3組血漿中的Aβ42水平，沒有類似發現，可能與本研究樣品量少、診斷標準、檢測對象及方法不同有關。

在MCI向AD轉化的病程中一個主要的病理改變是患者的海馬、大腦皮質及其他腦區出現大量Aβ淀粉樣沉積，而Aβ的形成與其前體蛋白APP的異常酶切加工有關。正常情況下APP經α分泌酶（ADAM10）裂解產生可溶性s APPα及C83，可溶性APP對神經細胞具有營養和保護作用，病理狀態下APP裂解由β，γ分泌酶介導，可產生大量致病性的Aβ42、Aβ40。BACE1是產生 Aβ的限速酶，其活性水平決定APP的代謝途徑。已經證實BACE1是一類天冬酰氨蛋白酶，其基因定位于人類的11q23.2染色體，全長2 526個堿基對，包含9個外顯子。BACE1表達同時受轉錄和翻譯水平的調控，但轉錄和翻譯調控的機制目前并不十分清楚。研究表明BACE1是一種應激蛋白，缺血［13］、缺氧［14］、腦損傷及能量剝奪［15］均可誘導BACE1mRNA表達上調及活性增加。O’Corner等的研究證實能量剝奪能夠激活轉錄啟動因子eIF2α磷酸化通道加快BACE1的轉錄效率，進而引起BACE1及Aβ的上調［16］。本研究中 AD、MCI患者的BACE1m RNA上調是否與慢性缺血、缺氧及能量障礙誘導的轉錄啟動因子eIF2α磷酸化有關，值得進一步研究。Sandra等報道MCI患者腦脊液中BACE1活性與P－tau、T－tau水平高度相關，推測BACE1表達上調的原因可能與磷酸化tau蛋白的調節有關［17］。另外，作為產生Aβ的限速酶，BACE1上調不僅提供了MCI分型診斷的臨床線索，同時還為MCI早期藥物干預提供了靶點。α－分泌酶與AD的關系目前還不明晰，其活性需通過神經遞質受體系統激活，故在實際應用中受到限制。

既往分析α、β－分泌酶基因表達水平所采用的方法如RT－PCR、Northern雜交以及RNA酶保護試驗等，操作繁雜，敏感性低且易于污染。本研究采用的實時熒光定量PCR法則克服了上述缺點［18］，在PCR反應過程中巧妙地將靶基因擴增、雜交及光譜檢測技術結合在一起，PCR擴增和終產物檢測全處于封閉的條件下進行，可以對靶基因的表達水平進行準確定量，易于臨床推廣。

總之，本研究成功建立了檢測α、β－分泌酶基因表達的實時熒光定量PCR法，并發現AD、MCI患者血小板β－分泌酶基因表達水平高于正常老人，其意義在于一方面顯示了血小板β－分泌酶基因表達上調可能與MCI的轉歸（向AD轉化）有關，要求對于MCI患者應盡早開展相關的酶學檢查，以實施早期藥物干預；另一方面提示β－分泌酶本身是一個值得干預的靶點。當然尚需要更大樣本量以及動態的追蹤研究進一步證實。

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