脂肪干細胞源性神經干細胞克隆球的電鏡觀察

劉永明 胡曉晴 張 譽 唐穎馨 唐洲平

脂肪組織中存在多能干細胞，在體外可長期增殖，這類細胞被稱為脂肪間充質干細胞，簡稱脂肪干細胞（adipose derived stem cells，ADSCs）。ADSCs以其獲取容易、創傷小、具有多分化潛能及避免倫理學問題等優勢逐漸獲得研究者的青睞［1，2］。ADSCs具備向脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、成肌細胞分化的潛能［3～6］，最近有報道ADSCs還可誘導分化為神經干細胞，進而向神經細胞分化［7～10］。ADSCs向神經干細胞誘導分化的相關研究較多，神經干細胞的超微結構已有學者觀察［11］，但對ADSCs誘導分化而來的神經干細胞超微結構的觀察卻不多。本研究旨在采用透射電鏡觀察ADSCs源性神經干細胞克隆球的超微結構。

1 材料與方法

1.1 ADSCs體外分離、培養和鑒定［12］

雄性健康SD大鼠，2只／次，體重120～150 g，由同濟醫學院實驗動物中心提供，許可證號為SYXK（鄂）2004－0007；實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。將大鼠麻醉后斷頸處死，置于75%乙醇中浸泡10 min后移入超凈臺。剪開腹股溝處的皮膚，暴露皮下脂肪組織，盡量避開血管，鈍性分離脂肪組織，將所獲得的脂肪組織用眼科剪反復剪碎，將剪碎后的脂肪組織移入離心管中，加入和剪碎的脂肪組織體積相等的0.1% Ⅰ型膠原酶（Gibco公司），在37℃恒溫搖床振蕩消化40 min，加入等體積基礎培養液［含10%胎牛血清（Hyclone公司）的DMEM培養液（Hyclone公司）］，中和消化液并稀釋細胞，用吸管反復吹打混勻，室溫下1100 r／min離心10 min，獲得下層細胞沉淀物。加入基礎培養液重懸細胞，室溫下1100 r／min離心4 min，去上清，加入基礎培養液重懸細胞，經200目濾網過濾細胞懸液后，接種至25 cm2培養瓶內，在飽和濕度、5%CO2、37℃標準環境下培養。以后每3 d全量換液1次，當細胞長滿培養瓶底達到70%～80%時進行傳代。

1.2 ADSCs分化成神經干細胞克隆球、鑒定及超微結構觀察

1.2.1 ADSCs向神經干細胞克隆球的誘導培養［8］原代培養的ADSCs細胞，按5×105／L細胞濃度接種于25 cm2規格的培養瓶中，加入Neurobasal培養基（Gibco公司）、20 ng／ml堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，b FGF）（sigma公司），20 ng／ml表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）（sigma公司）、2%B27添加劑（Gibco公司），置于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養，每3～4 d添加上述3種因子，每7 d換液1次。培養5～7 d后可見細胞在培養液中增殖形成懸浮的神經球樣細胞。當形成的神經球達到15～20個時，吸除一半培養基，機械法輕柔吹打神經球使之離散，再以Neurobasal培養基重懸細胞，按1∶3傳代。

1.2.2 克隆球鑒定 取誘導培養第10 d的神經球，采用免疫熒光法鑒定。將培養著神經球的培養液室溫下1500 r／min離心2 min，棄上液，加入2 ml neurobasal培養液重懸細胞，吹散，滴加到經多聚賴氨酸包被的6孔板中，沿側壁向孔內加入1 ml neurobasal培養液，37℃、5%CO2培養箱中孵育24 h，讓神經球貼壁。去掉6孔板中的培養液，PBS洗5 min×3次；4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗5 min×3次；0.25%Trixton X－100（Biosharp公司）500 μl破膜20 min，PBS洗5 min×3次；胎牛血清白蛋白（Hyclone公司）封閉非特異性抗原，室溫孵育1 h，PBS洗5 min×3次；吸掉殘液，滴加兔抗大鼠nestin一抗（Sigma公司，1∶150稀釋），4℃孵育過夜，PBS洗5 min×3次；滴加花青素3（Cyanine 3，Cy3）標記的羊抗兔二抗（Sigma公司，1∶50稀釋），室溫避光孵育1 h，PBS洗5 min×3次；50%甘油封片；熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.3 透射電鏡觀察 將懸浮的神經干細胞克隆球轉入到大試管中，室溫800 r／min離心10 min，將濃縮的細胞懸液轉入1.5 ml EP管中，室溫1500 r／min離心10 min，去除上清液，沿管壁緩慢加入1%戊二醛固定液（避免將細胞團打散），透射電子顯微鏡觀察（同濟醫學院超微病理研究室）。

2 結 果

2.1 光鏡下ADSCs及神經球形態

光學倒置顯微鏡下可觀察到，培養24 h后大部分ADSCs開始貼壁生長，呈成纖維樣細胞形態，見圖1A。ADSCs經誘導培養5 d即見神經球樣細胞出現，并逐漸增多，至10 d左右神經球樣細胞數量達到穩定，繼續培養至14 d左右開始出現變黑的神經球樣細胞團，見圖1B。

圖1 在光學顯微鏡下ADSCs及ADSCs經誘導分化后形成的神經球樣細胞團的形態 A為培養6 d后的ADSCs（×100倍）；B為ADSCs經誘導培養10 d后出現的神經球樣細胞團（×400倍）

2.2 神經球樣細胞團鑒定

對ADSCs經誘導分化后形成的神經球樣細胞團的免疫熒光鑒定顯示，其Nestin染色陽性，見圖2A－2C。

圖2 熒光顯微鏡下免疫熒光染色顯示神經球樣細胞團Nestin表達陽性（×400倍）

2.3 電鏡下神經球樣細胞團形態

透射電鏡下觀察ADSCs經誘導分化后形成的神經干細胞克隆球，可見細胞間有增厚的細胞膜相連（圖3A箭頭所指），或通過一些連接結構相連（圖3B箭頭所指）；單個細胞的胞體較小，細胞核較大，胞質較少，有多種細胞器（圖3C）。

3 討 論

ADSCs經Zuk等［12］報道后，近年來其研究獲得了迅速的發展。ADSCs是從脂肪組織中分離出來的、具有多向分化潛能的成體干細胞。以往研究發現，ADSCs與臨床上已廣泛應用的骨髓間充質干細胞無論在形態、生長特性、分子表型及多向分化能力方面都具有很高的相似性。二者相比，ADSCs來源充足、取材容易、分離培養步驟簡便、體外增殖能力強、沒有倫理學問題，比骨髓間充質干細胞有更多的優點。這些特點決定了ADSCs在臨床應用中擁有更廣闊的前景。

圖3 透射電鏡下ADSCs經誘導分化后形成的神經干細胞克隆球內細胞的形態（A為標尺＝1μm；B和C為標尺＝0.5 μm）

ADSCs向神經干細胞的誘導分化是目前相當前沿的一個研究領域，是對傳統的神經細胞不可再生理論的挑戰。傳統觀點認為，神經細胞不可再生，神經損害性疾病基本上無法修復。但近些年的研究卻顯 示，神 經 細 胞 并 非 不 可 再 生［10］。2000 年Woodbury等報道在含有二甲基亞砜（DMSO）和丁酸酯羥基茴香醚（BHA）或β－巰基乙醇的DMEM培養液中可將成年大鼠和成人的骨髓基質細胞定向誘導分化為神經細胞［13］。隨后大量的研究也證實骨髓基質細胞可定向分化為神經元和神經膠質細胞［14～20］。因ADSCs和骨髓基質干細胞具有高度的相似性，研究者們推測ADSCs也具有分化為神經細胞的可能。Safford等2002年報道在一定的誘導條件下和一定的時間內人和大鼠的ADSCs分化的細胞具有神經細胞形態，免疫細胞化學檢測證實分化的細胞分別表達巢蛋白（nestin）、膠質纖維酸性蛋白（glia fibrillary acidic protein，GFAP）、神經元核蛋白（vimentin）和神經元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE），提示ADSCs經誘導分化可以表達神經細胞的表型［21］。本研究所采用的誘導方法源自Kang等的誘導方法［8］，采用在Neurobasal培養基中加入20 ng／ml b FGF、20 ng／ml EGF、2%B27，經過5 d左右的誘導分化即可出現神經球樣細胞團，10 d左右神經球細胞團數量達到穩定，經免疫熒光染色鑒定顯示Nestin陽性，提示ADSCs經過誘導分化后可以表達神經干細胞的表型。

關于ADSCs向神經干細胞的誘導分化目前已有一些研究報道［22，23］，但對于 ADSCs誘導分化后形成的神經球樣細胞團的超微結構的研究卻很少，本研究即采用透射電鏡，對其超微結構進行研究。本研究結果顯示，由ADSCs誘導分化而來的神經球樣細胞團的超微結構和原代培養的神經球的超微電鏡結構相似［11］，都表現為大部分細胞的胞體較小，胞核較大，胞質少且透明，有微管、微絲、線粒體、高爾基體、糖原等細胞器；部分神經球內的細胞之間可看到多種形態的連接樣結構。就單一神經球而言，未觀察到突觸形成，推測突觸一般只在神經組織中存在，而單一的細胞團之間很難出現典型的突觸結構。另外，神經干細胞本身的突觸結構也不明顯。

本研究結果進一步證實ADSCs有向神經干細胞誘導分化的可能。此外，本研究創新性地采用透射電鏡，對ADSCs源性的神經干細胞團的超微結構形態特征進行了觀察，并與原代培養獲得的神經干細胞形態進行比較，發現二者具有相當程度的相似性。ADSCs研究的迅猛發展無疑會推動神經內科疾病治療方法多樣性的發展，為臨床工作提供更多的幫助。

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