低分子肝素對大鼠大腦皮層神經細胞缺血再灌注損傷的保護作用

張忠勝 梅元武 蘇慶杰 容瓊文

低分子量肝素（LMWH）是普通肝素經化學或酶法解聚而得，目前主要用于血栓栓塞性疾病的防治［1，2］。已有臨床資料表明LMWH 可使缺血性腦血管疾病患者神經功能缺損較好恢復，出血少，療效好，降低病死率和致殘率［3，4］。但低分子肝素是否對體外培養的缺血缺氧損傷神經細胞有直接保護作用，目前相關的報道甚少。

本研究采用體外培養原代大鼠大腦皮層神經細胞的方法，通過氧糖剝奪建立細胞缺血再灌注損傷模型，觀察LMWH是否具有抗神經細胞缺氧性損傷的作用，并探討其可能作用機制，為臨床應用其治療缺血性腦血管病提供理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 新生（出生24 h內）雄性SD大鼠由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供（合格證號：SCXK（鄂）2010－0007）。

1.1.2 主要試劑 低分子肝素鈉（武漢祥云博生物公司，平均分子量5KD）；DMEM高糖培養基、胎牛血清、馬血清購自HyClone公司；神經元特異性烯醇化酶（NSE）購自武漢博士得生物公司；0.25%胰蛋白酶、Neuronbasal培養液、B27添加劑購自GIBCO公司；L－多聚賴氨酸、熒光染料Hoechst33258、阿糖胞苷（Ara－c）、HEPES購自Sigma公司。An－nexin V－FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天公司。

1.1.3 主要儀器

超凈工作臺：蘇凈集團安泰公司；恒溫細胞培養箱：Napco 5410－220，（美國）；倒置相差顯微鏡：OLYMPUS公司（日本）；熒光顯微鏡：OLYMPUS公司；流式細胞儀：FACSCLSR，Becton－Dickton（美國）；Dynatech MR 4000型ELISA讀數儀（日本）；

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠大腦皮層神經細胞的培養與鑒定取新生SD大鼠，冰凍麻醉后用75%乙醇消毒，無菌條件下剪剝頭皮、顱骨，取腦，將腦組織置于冷無菌PBS液中，剔除腦膜、血管，分離出整個大腦，PBS液沖洗3次，用眼科剪剪成1 mm3的碎塊，加入0.25%胰酶，37℃溫箱內消化20 min，完全培養液終止消化10 min，用滴管吹打混勻后在1000 r／min下離心5 min，棄上清，加完全培養液5 m1，過200目篩網，1000 r／min下離心5 min，棄上清，加完全培養液重新懸浮細胞，用吸管輕輕吹打，超凈臺靜置10 min，調整細胞密度，以1×106／ml的密度種植于預先用多聚賴氨酸包被的細胞培養瓶內，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養24 h后換維持培養液，第3 d開始在培養液中加入阿糖胞苷作用48 h，然后更換培養液，以后每周換液2次，每次換半量；接種第7 d可見神經細胞突起連接成網，可用于后續試驗；采用神經元特異性烯醇化酶（NSE）免疫熒光染色鑒定神經細胞。

1.2.2 大鼠神經細胞體外模擬缺血再灌注模型的建立 缺血再灌注組模型的建立參照Goldberg，Meloni［5，6］等的方法，并略作改動；取培養7 d的神經細胞，吸去原培養液，清洗后加入無糖Earle＇s液，將細胞培養瓶置于缺氧罐內，向罐內持續緩慢通入含有95%N2和5%CO2的混合氣體以排除空氣；通氣30 min后夾閉缺氧罐的進口與出口，置于培養箱內密閉6 h（體外模擬缺血，ischemia，IS），取出缺氧罐，吸去無糖Earle＇s液，換回維持培養液，放回37℃、5%CO2培養箱中繼續培養（再灌注，reperfusion，RE）24 h后進行后續實驗。

1.2.3 低分子肝素對缺血再灌注神經細胞活力的作用

培養原代神經細胞至7 d，分組：（1）對照組；（2）IS／RE組；（3）IS／RE＋LMWH 組（按濃度不同又分為4個組，LMWH在造IS／RE模型前2 h加入）。MTT法檢測細胞活力：取原代神經細胞（細胞計數1×106／ml），按每孔100μl接種于96孔板，設置空白對照組（用來調零，只加培養基，不加細胞）、陰性對照組（藥物濃度為零，加細胞，加培養基）、藥物組（加藥物，加細胞，加培養基），繼續培養24 h，每孔加入MTT 15 ul，37℃孵育4 h，鏡下觀察形成紫色針狀結晶，棄去上清，每孔加入DMSO100 ul，室溫下放置10 min；待鏡下觀察紫色結晶全部溶解后，以Dynatech MR 4000型ELISA讀數儀測定MTT吸光度值，檢測波長為570 nm。計算細胞存活率（%）＝（實驗組OD值／對照組OD值）×100%；篩選合適LMWH濃度進行后續實驗。

1.2.4 Annex in V－FITC／PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡率變化

常規方法操作。分組：（1）對照組；（2）IS／RE組；（3）IS／RE＋LMWH組。后續試驗均按此分組。操作方法參照試劑盒說明書進行，上機檢測細胞凋亡率，重復試驗3次。

1.2.5 細胞內［Ca2＋］測定 采用雙波長熒光分光光度計法，每組實驗至少重復3次。

1.2.5.1 制備細胞懸液 原代神經細胞培養至7 d；用0.25%的胰蛋白酶37℃消化10分鐘，再用含10%胎牛血清的DMEM終止消化，1000 r／min離心5 min，以Hank液洗滌一遍，用含0.4%牛血清白蛋白的臺氏液（Tyrode）制成懸液，要求細胞密度為1x106／ml；用0.4%臺盼藍（Trypan Blue）溶液做排斥實驗，計數活細胞和死細胞，并計算細胞存活率，要求存活率達到90%以上。

1.2.5.2 負載Fura－2／AM 向37℃預溫的細胞懸液中加入10ulCa2＋熒光指示劑Fura－2／AM（終濃度4μM），于37℃避光孵育負載45 min。負載后以臺氏液清洗，1000 r／min離心5 min，用含0.4%牛血清白蛋白的臺氏液（Tyrode）重新懸浮細胞，調整細胞密度為1x106／ml。

1.2.5.3 測定熒光強度 激發波長340 nm、380 nm，發射波長510 nm，37℃恒溫下測定。Fura－2／AM 檢測的［Ca2＋］i計算公式為：［Ca2＋］i＝Kd［（RRmin）／（Rmax－R）］（Fmin／Fmax）。其中，Kd為 Fura－2與Ca2＋反應的解離常數，為224 n M；R為各測定點F340／F380熒光強度比值；Rmax、Rmin分別為測定的最大和最小熒光比值：加破膜劑Triton X－100（終濃度為0.1%），使Fura－2和Ca2＋結合達飽和時，測得的F340／F380為Rmax；加入高濃度的 Ca2＋螯合劑EGTA（終濃度為5 m M，p H 8.5），以充分螯合 Ca2＋，使Fura－2游離，測得的F340／F380為Rmin；Fmin、Fmax分別代表Ca2＋為零及飽和時，在380 nm激發光下測得的Fura－2熒光強度（F380）。

1.2.6 統計學處理

2 結 果

2.1 原代大鼠皮層神經細胞的培養與鑒定

原代SD大鼠大腦皮層神經細胞體外培養至第7天，可見神經細胞生長旺盛，胞體飽滿，胞核明顯，突起延長，相互間連接成網絡 （圖1）。細胞免疫熒光染色顯示胞漿及突起顯亮綠色熒光，呈NSE陽性，證明神經細胞培養成功（圖2）。

圖1 培養至7 d的神經細胞的突起明顯，相互間連接成網絡（×200倍）

圖2 神經細胞免疫熒光鑒定 NSE染色呈綠色熒光（×200倍）

2.2 低分子肝素對缺血再灌注損傷神經細胞活力的作用

MTT法檢測顯示，對照組細胞在未加任何干預的情況下其在570 nm處的光密度值（OD值）為0.851；缺血再灌注組（IS／RE）的 OD值明顯降低，為0.648，與對照組比較有明顯差異，IS／RE＋LMWH各組均可見OD值有升高，但只有濃度為0.5、2.5、5.0三個組的差異有統計學意義，其中LMWH濃度5.0μg／m組OD值升高最明顯，達到0.760，但仍低于對照組（表1）。

表1 各組的光密度值及細胞存活率（x±s）

表1 各組的光密度值及細胞存活率（x±s）

注：與對照組比較，ΔP＜0.01；與IS／RE組比較，＃P＞0.05；與IS／RE組比較，φP＜0.01

組別 LMWH濃度（μg／ml）光密度值（OD值）細胞存活率（%）31 034 100缺血組 — 0.648±0.030Δ 76.15低分子肝素組 0.1 0.653±0.029＃ 76.73 0.5 0.718±0.013φ 84.37 2.5 0.737±0.005φ 86.60 5.0 0.760±0.003φ 89.對照組 — 0.851±0.

2.3 Annexin V－FITC和PI聯合染色檢測各組細胞凋亡率

對照組神經細胞的凋亡率較低，為4.6%；體外模擬缺血6 h再灌注24 h后細胞凋亡率明顯增加，為19.6%，兩組比較差異明顯（P＜0.01）；低分子肝素組在缺血前2 h加入LMWH后細胞凋亡率與缺血組比較有明顯下降，為10.51%，差異明顯（P＜0.01）（圖3、4）。

圖3 各組細胞的凋亡率

圖4 各組的流式凋亡率柱狀圖比較 1為對照組，2為缺血再灌注組，3為缺血再灌注＋低分子肝素組

2.4 低分子肝素對缺血再灌注損傷神經細胞胞漿鈣離子濃度的調節作用

雙波長熒光分光光度計法測定各組鈣離子濃度，對照組胞漿［Ca2＋］i為（83.81±2.99）nmol／L；缺血再灌注處理后神經細胞胞漿［Ca2＋］i為（142.13±4.23）nmol／L，明顯高于對照組，差異明顯；低分子肝素預處理后的缺血再灌注損傷神經細胞其［Ca2＋］i為（112.61±4.06）nmol／L，明顯低于缺血再灌注組（P＜0.01）（表2）。

表2 各組細胞的［Ca2＋］i比較（±S）

表2 各組細胞的［Ca2＋］i比較（±S）

注：與對照組比較，ΔP＜0.01；與IS／RE比較，φP＜0.01

組別 ［Ca2＋ ］i：99 IS／RE組 142.13±4.23Δ IS／RE＋LMWH組 112.61±4.06Δφ對照組 83.81±2.

3 討 論

Ca2＋是細胞重要的第二信使之一，有著廣泛而復雜的生物學功能，能調節神經遞質的釋放和神經元的興奮性。維持細胞內的鈣穩態具有重要意義，目前已知內質網和線粒體是細胞內兩種主要的鈣庫，當前研究認為細胞內的鈣穩態主要是通過內質網來保持的［7］。內質網上有3種與鈣離子的攝入和釋放相關的通道：向胞漿釋放鈣離子的藍尼啶受體通道（ryanodine receptor，Ry R）和1，4，5－三磷酸肌醇受體通道（inositol，1，4，5－triphosphate receptor，IP3R）以及將鈣離子由胞漿泵至內質網中的鈣泵通道（Ca2＋ATPase）（Sarcoplasmic／endoplasmic reticulum Ca2＋ATPase，SERCA）。在正常的情況下內質網主要通Ry R和IP3R將內質網腔內的鈣離子釋放入胞質，通過鈣泵從胞漿中攝取鈣離子入內質網，從而使內質網、胞質中的鈣離子達到動態平衡。缺血再灌注時鈣離子的這種平衡穩態被破壞，細胞內鈣超載，胞質內游離鈣離子濃度增高，從而引起細胞損傷［8］。本研究顯示對照組［Ca2＋］i為83.81 nmol／L，缺血再灌注組為142.13 nmol／L，明顯高于正常組，從而也證明了這一點。

目前已明確肝素不僅可作為抗凝劑用于防治血栓性疾病，而且還是內質網IP3R受體的特異性拮抗劑，可以拮抗IP3所介導的內質網鈣庫的鈣釋放［9］。然而由于普通肝素分子量大，難以透過細胞膜，體外實驗時須采用特殊方法注射入細胞內才能起作用，而且因出血等副作用較多也限制了其臨床應用。而分子量較小的LMWH則可以通過血腦屏障和細胞膜，從而發揮一系列生物學作用。但是LMWH是否也能拮抗IP3IP3所介導的內質網鈣庫的鈣釋放，目前尚無肯定報道。

本研究采用不同濃度的低分子肝素作用于缺血缺氧誘導的細胞，結果表明在一定濃度范圍內（0.1～5.0μg／ml），LMWH 均能提高細胞的存活率，在0.1μg／ml時細胞活力與對照組無明顯差異，但0.5 μg／ml、2.5μg／ml、5.0μg／ml三個濃度作用后細胞活力均明顯高于對照組，差異有統計學意義，且該效應呈劑量依賴性。進一步測各組細胞凋亡率發現，對照組為4.6%，缺血再灌注模型組為19.6%，而經5.0μg／ml LMWH預處理組細胞凋亡率明顯下降，為10.51%，顯示LMWH具有明顯的抗缺血再灌注損傷誘導的神經細胞凋亡作用。通過測定各組細胞的胞質 ［Ca2＋］i，發現 LMWH 預處理組的胞質［Ca2＋］i為112.6 1nmol／L，明顯低于缺血再灌注組的142.13 nmol／L。由此本研究推測，低分子肝素的這種神經保護作用可能是通過拮抗神經細胞內質網的IP3R，抑制缺血再灌注時內質網內的Ca2＋經IP3R釋放，從而減輕鈣超載，降低胞質鈣離子濃度產生的。這也可能是低分子肝素治療血栓性疾病有效的另一機制。

1 Harrington DW，Jindeel A.Fixed－dose unfractionated heparin vs low－molecular－weight heparin for venous thromboembolism.JAMA，2007，297（3）：262.

2 Uchino K.low－molecular－weight heparin is better than unfractionated heparin to prevent VTE after ischemic stroke.ACP J Club，2008，149（1）：8.

3 莊偉端，鄭俊忠，巫順秀.低分子肝素治療急性腦梗死的臨床研究.卒中與神經疾病，2001，8（1）：43.

4 王思鴻，許麗珍.低分子肝素治療急性腦梗死療效觀察及對凝血功能的影響.卒中與神經疾病，2002，9（1）：49－51.

5 Goldberg MP，Choi DW.Combined oxygen and glucose deprivation in cortical cell culture：calcium－dependent and calcium－independent mechanisms of neuronal injury.J Neurosci，1993，13（8）：3510－3524.

6 Meloni BP，Majda BT，Knuckey NW.Establishment of neuronal in vitro models of ischemia in 96－well microtiter strip－plates that result in Acute，progressive and delayed neuronal death.Neuroscience，2001，108（1）：17－26.

7 Verkhratsky A，Toescu EC.Endoplasmic reticulum Ca（2＋）homeostasis and neuronal death.J Cell Mol Med，2003，7（4）：351－361.

8 Harukuni I，Bhardwaj A.Mechanisms of brain injury after global cerebral ischemia.Neurol Clin，2006，24（1）：1－21.

9 Zima AV，Blatter LA.Inositol－1，4，5－trisphosphate－dependent Ca（2＋）signalling in cat atrial excitation－contraction coupling and Arrhythmias.J Physiol，2004，555（Pt3）：607－615.