醒腦靜注射液調控NF-κB信號通路對膿毒癥心肌損傷的影響

胡丹丹 陳 偉 孫 鑫

（1.浙江中醫藥大學附屬第三醫院，浙江 杭州 310005；2.上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海200030）

膿毒癥是嚴重創傷、感染、休克等多種應激狀態下的常見并發癥，發病率高，死亡率高。膿毒癥死亡與其易導致多臟器功能損傷有密切關系。膿毒癥中醫辨證多從毒、瘀、痰入手，但在膿毒癥心肌損傷時患者多表現為毒熱神昏，治療當以醒神開竅祛除瘀毒。因此，本研究以大鼠盲腸結扎穿孔（CLP）法建立膿毒癥模型，觀察醒腦靜注射液對膿毒癥大鼠的心臟保護效應，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物雄性 Wistar大鼠，清潔級，體質量（200±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。造模前適應性喂養7 d。

1.2 主要儀器低溫離心機 （Eppendorf Centrifuge 5804德國）；紫外分光光度計（BECKMANDU-600，美國）；電泳轉膜裝置（Bio-RAD，美國）；數顯恒溫水浴鍋（泰州市華普達教學儀器有限公司）；Model 550 酶標儀（Bio-Rad，美國）；Bio Sen SC300 凝膠圖象分析系統（上海山富科學儀器有限公司）；PTC-225 Peltier Thermal Cycler（MJ Research Inc，Waltham，Massachusetts）；Rotor-Gene RG-3000 Real-Time Thermal Cycler （Corbett Reseach，Sydney，Australia）等。

1.3 藥物與試劑醒腦靜注射液（無錫濟民可信山禾藥業股份有限公司生產，批號：國藥準字Z32020563）。戊巴比妥鈉（上海西塘生物科技有限公司）。氯仿，異丙醇，二硫代蘇糖醇（DTT）（0.1 mol/L），RNasin（40 U/μL），dNTP（10 mmol/L），隨機引物，D NaseI（5 U/μL），逆轉錄酶，SYBRI，50×Calibration，HS ExTaq 酶及 10×Buffer等；大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒（煙臺賽爾斯公司）；Light Shift化學發光凝膠遷移實驗（EMSA）試劑盒（Pierce，美國）；核蛋白提取試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）；Bradford蛋白質定量試劑盒（天根生化科技有限公司）；Trizol Reagent（Invitrogen，美國）。

1.4 模型制備參照文獻［1］報道以CLP法制備膿毒癥模型。

1.5 分組及給藥大鼠分為6組：正常組、假手術組、模型6 h組、模型24 h組、醒腦靜6 h組及醒腦靜24 h組，每組8只。正常組與其余各組同步飼養，麻醉后腹主動脈采血處死；模型6 h組、醒腦靜6 h組行CLP術后，分別尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液5 mL/kg、醒腦靜注射液5 mL/kg；模型24 h組、醒腦靜24 h組行CLP術后，分別于0、6、12 h尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液5 mL/kg、醒腦靜注射液5 mL/kg。

1.6 標本采集與檢測模型6 h組、醒腦靜6 h組和模型24 h組、醒腦靜24 h組分別于CLP術后6、24 h麻醉并腹主動脈采血處死留取標本行相關指標檢測。假手術組麻醉后開腹翻動腸道，關腹，24 h后麻醉，腹主動脈采血處死，留取標本行相關檢測。（1）使用自動生化分析儀測定肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）。（2）ELISA 檢測心肌組織 TNF-α 蛋白含量，按試劑盒說明書進行操作。（3）熒光定量PCR（PT-PCR）法檢測心肌組織TNF-α mRNA表達。Trizol常規法抽提各組心肌組織總RNA，去除基因組DNA；RNA定量后逆轉錄為cDNA；引物TNF-α：5＇–TCCTTCAGACACCCTCAACC-3＇；3＇-AGGCCCCAGT TTGAATTCTT-5＇，GAPDH：5＇-GAGTCAACGGA TTTGGTCGT-3＇；3＇-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-5＇。 取樣本總 cDNA 1 μL、上游和下游引物各0.5 μL，加入試劑盒其他成分，樣品TNF-α、GAPDH循環條件為：94℃預變性5 min；接著進行45個循環，95℃變性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 40 s；最后 72℃延伸5 min。將預試驗的PCR產物以10倍濃度梯度進行稀釋，選擇1/10000，1/100000，1/1000000，1/10000000 濃度的稀釋產物作為標準品模板，進行熒光定量PCR反應并同時在熒光定量PCR儀中輸入以上4個濃度梯度的數值。通過這4個標準品生成的反應數據，軟件Rotor-Gene6.0根據反應的熒光實時監控數據和標準品的濃度關系，生成標準曲線。通過此標準曲線來計算在標準曲線所劃定的CT值。以GADPH為內參，計算目的基因與GADPH的比值，比值即為擴增產物定量相對值。（4）EMSA法檢測心肌組織NF-κB活性。按核蛋白提取試劑盒說明書提取核蛋白，Bradford法測定核蛋白濃度。 核轉錄因子-κB（NF-κB）的探針序列：生物化標記，5'-AGTTGAGGGGA CTTTCCCAGGC-3'；3'-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5'。按照試劑盒的說明書要求操作，配制20μL檢測結合反應體系，進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，固定，化學發光檢測生物素標記DNA，X線下曝光顯影，用分析軟件將圖片上的特異條帶灰度值數字化。

1.7 統計學處理采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，相關性分析采用簡單線性回歸分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌酶譜變化見表1。模型24 h組、醒腦靜24 h組、模型6 h組、醒腦靜6 h組心肌組織CK-MB、CK均較假手術組明顯升高（P＜0.05）；模型24 h組、醒腦靜24 h組心肌組織CK-MB、CK均較模型6 h組、醒腦靜6 h組明顯升高（P＜0.05或0.01）；模型24 h組心肌組織CK-MB、CK水平高于醒腦靜24 h組（P＜0.05）；模型6 h組心肌組織CK-MB、CK水平高于醒腦靜6 h組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠心肌酶CK-MB、CK比較（U/L，±s）

表1 各組大鼠心肌酶CK-MB、CK比較（U/L，±s）

與模型組同時間點比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 n CK-MB CK正常組 8 2083.10±659.52 1001.87±254.07假手術組 8 2199.35±559.58 1195.40±248.37模型 6 h組 8 3230.85±644.83△ 1774.72±505.86△醒腦靜 6 h組 8 2578.88±532.98*△ 1331.58±309.94*△模型 24 h組 6 4218.55±384.55△△ 3234.75±569.31△△醒腦靜 24 h 組 6 3559.27±345.67*△△ 1969.45±542.61*△△

2.2 各組大鼠心肌組織TNF-α水平變化見表2。模型24 h組、醒腦靜24 h組、模型6 h組、醒腦靜6 h組心肌組織TNF-α含量及TNF-α mRNA表達均高于假手術組 （P＜0.05或0.01），模型24 h組、醒腦靜24 h組心肌組織TNF-α含量及TNF-α mRNA表達均較模型6 h組、醒腦靜6 h組降低（P＜0.05）；醒腦靜24 h組心肌組織TNF-α含量及TNF-α mRNA表達低于模型24 h組 （P＜0.05）；醒腦靜 6 h組心肌組織 TNF-α含量及TNF-α mRNA 表達低于模型 6 h組（P＜0.01）。

表2 各組大鼠心肌組織TNF-α水平比較（±s）

表2 各組大鼠心肌組織TNF-α水平比較（±s）

組 別 n TNF-α蛋白含量（ng/mL） TNF-α mRNA表達正常組 8 12.6808±0.8651 1769.1078±172.0320假手術組 8 13.4787±2.2911 2018.1289±174.1766模型 6 h組 8 23.8726±2.0491△△ 19840.8051±1169.1709△△醒腦靜 6 h組 8 18.1155±3.3767**△ 16816.4239±367.6749**△△模型 24 h組 6 20.2241±1.1088△△ 5772.4474±418.5459△醒腦靜 24 h組 6 16.7476±2.3094*△ 3560.0677±418.5459*△

2.3 各組大鼠心肌組織NF-κB表達變化見表3，圖1。模型24 h組、醒腦靜24 h組、模型6 h組、醒腦靜6h組心肌組織NF-κB蛋白表達均高于假手術組（P＜0.05或0.01），模型24 h組、醒腦靜24 h組心肌組織NF-κB蛋白表達均較模型6 h組、醒腦靜 6 h組降低（P＜0.05）；醒腦靜24 h組心肌組織NF-κB蛋白表達低于模型24 h組（P＜0.05）；醒腦靜6 h組心肌組織NF-κB蛋白表達低于模型6 h組（P＜0.01）。

表3 各組大鼠心肌組織NF-κB活性比較（±s）

表3 各組大鼠心肌組織NF-κB活性比較（±s）

組 別 n NF-κB正常組 8 2895.1217±161.9397假手術組 8 3192.9800±643.0317模型 6 h 組 8 5589.6167±348.8476△△醒腦靜 6 h 組 8 4120.2967±302.7574**△△模型 24 h 組 6 4476.6033±211.9653△醒腦靜 24 h 組 6 3801.7850±424.2036*△

圖1 各組NF-κB活性變化

2.4 心肌酶與TNF-α、NF-κB相關性分析線性回歸分析示：各組大鼠 CK、CK-MB與各組心肌組織 TNF-α蛋白、TNF-α mRNA表達及NF-κB活化呈正相關（P＜0.01）；心肌組織TNF-α mRNA表達和TNF-α蛋白合成成正相關，相關系數r為0.674（P＜0.01）；TNF-α蛋白合成水平和NF-κB活性改變成正相關，相關系數 r為 0.732 （P＜0.01）； 而 NF-κB活性改變與 TNF-α mRNA表達水平呈正相關，相關系數r為0.682（P＜0.01）。

3 討 論

對于膿毒癥的發生機制，現較公認的涉及內毒素釋放、細胞因子分泌異常、凝血通路異常、基因多態性、細胞信號傳導異常等因素，但最與臨床符合的為細胞信號傳導異常，導致細胞因子釋放異常，繼而導致器官損傷。在細胞信號傳導中研究最為廣泛的為NF-κB信號傳導通路。NF-κB廣泛存在于多種細胞，參與機體免疫應答和炎癥反應，能與許多細胞因子和炎癥介質的基因啟動子區域的固定核苷酸序列結合，啟動TNF-α、白細胞介素（IL）-1、IL-6等細胞因子的基因表達，調控NF-κB活性及其相關信號轉導通路能有效抑制多種炎癥介質的超量釋放，阻止失控的炎癥反應，對膿毒癥的治療具有重要意義。因此本研究觀察了NF-κB表達及其下游細胞因子表達的情況，通過對該通路的觀察了解醒腦靜注射液對抗膿毒癥心肌損害的作用機制。

膿毒癥患者多因久病體衰，或外傷卒病，致使機體正氣不足，氣血陰陽失衡，衛外不固，令邪毒有內侵之機。外來之毒擾亂機體正常代謝及功能，入里化熱，變生熱毒；熱毒煎熬血液，加之氣虛無以行血，則血流瘀滯，津液停化為痰濁，毒熱、瘀血、痰濁等內生之毒隨之而生；內外之毒相互蘊結，阻遏三焦氣機，灼傷氣陰及脈絡，臟真受損，機體陰陽氣血逆亂，內生更多毒邪，形成惡性循環。因此，清熱解毒以祛除外來、內生之毒邪，是治療膿毒癥的核心環節之一。醒腦靜注射液由安宮牛黃丸經減味而成，主要成分為麝香、冰片、梔子，具有清熱瀉火，涼血解毒之效。既往研究表明其能抑制TNF-α、IL-6和IL-1表達［2］，減輕內毒素誘導的膿毒癥肺損傷［3］，但未對膿毒癥心肌損傷進行研究，也未進一步從炎癥信號傳導通路進行深入機制研究。本研究數據顯示，CLP術后，模型6 h組CK-MB、CK均出現不同程度的升高，模型24 h組則顯著高于假手術組和模型6 h組（P＜0.05）。表明隨著時間延長，膿毒癥心肌損害逐漸加重。而醒腦靜6 h組和醒腦靜24 h組心肌酶學指標均較模型組降低，同時醒腦靜24 h組心肌酶學低于醒腦靜6 h組，表明隨著醒腦靜的使用，可以減輕細菌毒素誘導的膿毒癥心肌損害，證明醒腦靜注射液對膿毒癥心肌損傷具有保護作用。

本研究顯示膿毒癥大鼠模型6 h組、模型24 h組大鼠心肌組織中TNF-α基因轉錄蛋白合成、NF-κB活化均明顯增高，且模型24 h組較模型6 h組上述指標明顯升高，這種升高與模型組各組心肌酶學指標升高相似。而在醒腦靜6 h組和24 h組，上述指標雖較假手術組高，但升高程度明顯低于模型6 h組和模型24 h組，證明醒腦靜注射液可以調控NF-κB信號通路表達，進一步對上述指標進行相關性分析顯示：TNF-α蛋白合成與NF-κB激活存在正相關，NF-κB激活與 TNF-α mRNA水平升高亦存在正相關，而TNF-α mRNA轉錄與TNF-α蛋白合成也存在正相關，并且心肌酶學改變與TNF-α蛋白、NF-κB激活呈正相關。提示膿毒癥大鼠在造模后出現的心肌酶學異常與NF-κB激活，進而促進細胞因子TNF-α蛋白表達增多有關。證明醒腦靜注射液可抑制TNF-α，調節NF-κB信號轉導通路，進而抑制膿毒癥炎癥和免疫反應，改善膿毒癥心肌損傷也進一步證實了清熱解毒療法在膿毒癥治療中的作用機制。

［1］金惠銘.盲腸結扎穿剌后的大鼠敗血癥模型［J］.中國病理生理雜志，1990，6（2）：126-128.

［2］陳堅，張素平，徐武華，等.醒腦靜注射液對急性腦出血患者血中細胞因子水平影響的研究［J］.中國中西醫結合急救雜志，2004，11（4）：224-226.

［3］王進，楊光田，喬禮芬，等.醒腦靜注射液對內毒素誘導大鼠肺泡巨噬細胞核轉入因子-κb激活和細胞因子產生的影響［J］.中國中西醫結合急救雜志，2008，15（4）：212-215.