32種中藥水提取物的體外抗菌活性研究

曾富強，王 斌，李旭廷，李金良，詹素瓊，袁定勝，梁 歌

（四川省畜牧科學研究院，四川 成都 610066）

隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，越來越多的病原菌對常用抗生素產(chǎn)生耐藥性，且耐藥程度日益加深。同時，由于化學合成藥物開發(fā)的難度大、毒副作用明顯，人們對從傳統(tǒng)天然藥物特別是中草藥中尋找抗微生物感染的新藥越來越關(guān)注。為了進一步發(fā)現(xiàn)更多的具有抗感染作用的中草藥，探索其抗菌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，筆者此次對32種中草藥水提取物抑制大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌的活性進行了篩選研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 中藥 大力子、黃柏、牛蒡子、赤芍、連翹、麻黃、秦艽、黃連、穿心蓮、馬齒莧、紫蘇子、牡丹皮、生地、苦參、山豆根、益母草、車前子、蒲公英、龍膽、大青葉、香薷、黃芩、白頭翁、黃荊、千里光、薄荷、石斛、白芷、知母、梔子、青蒿、射干等32味中藥飲片，均購自成都德仁堂藥店。

1.2 菌株 3株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）由本實驗室從臨床病例中分離保存；金黃色葡萄球菌CVCC1882，大腸桿菌CVCC2801均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 培養(yǎng)基 MH瓊脂和MH肉湯培養(yǎng)基（杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)）。

1.4 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、微量移液器等。

1.5 其他材料 96孔板。

2 方法

2.1 中藥提取物的制備 采用傳統(tǒng)水煎法。蒸餾水預(yù)先浸泡1h，加熱煎煮2次，第一次保持微沸30min，濾出藥液；藥渣加溫水再煮沸，仍保持微沸30min，濾出藥液。合并2次濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至生藥含量為1 g/mL。

2.2 細菌懸液的制備 將保存菌種接種于MH肉湯中，置于37℃恒溫箱中復活16～24h。平板劃線后倒置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。挑取3～5個菌落于裝有生理鹽水的試管，調(diào)整渾濁度至0.5麥氏比濁度（1～2×108CFU/mL）備用。

2.3 微量肉湯法測定32種中藥提取物對金黃色葡萄球菌CVCC1882和大腸桿菌CVCC2801的MIC值 取無菌96孔板，分別于每一排的第一孔加中草藥提取物（1g/mL）200μL，其余各孔均加入 MH肉湯100μL，于第一孔取100μL藥液加入第二孔，充分混勻后再從第二孔取100μL于第三孔，以此類推，最后一孔不加藥液，作為陰性對照。同時以青霉素作為陽性對照，濃度分別為：50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.3μg/mL、3.1μg/mL、1.6μg/mL、0.8μg/mL、0.4μg/mL、0.2μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0μg/mL。將稀釋至0.5麥氏比濁度的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌標準菌懸液再稀釋100倍，并分別加入加了藥液的96孔板，每孔100μL。每排藥液的最終濃度為：500mg/mL、250mg/mL、125mg/mL、62.5mg/mL、31.3mg/mL、15.6mg/mL、7.8mg/mL、3.9mg/mL、2.0mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0mg/mL。菌液加好后置無菌盒中，37℃恒溫箱培養(yǎng)24h。

2.4 結(jié)果判定 在黑色背景的光源下與對照組孔（包括青霉素對照、肉湯對照）作比較，檢測菌株的生長情況。若96孔板內(nèi)肉湯呈混濁生長，孔底出現(xiàn)沉淀等判斷為有菌生長；反之，澄清為無菌生長。無細菌生長孔所含的最低抗菌藥物濃度即為MIC值（最低抑菌濃度）。

最后，篩選出具有較好抑菌活性的11種中草藥提取物，用微量肉湯稀釋法測定其對3株MRSA的MIC值，以標準金黃色葡萄球菌作對照。

3 結(jié)果

3.1 32種中草藥提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌標準菌株的體外抑菌作用 結(jié)果見表1。32味中草藥提取物中，對大腸桿菌標準菌株有抑菌作用的有19味，對金黃色葡萄球菌標準菌株有抑菌作用的有23味，同時對兩者都有抑菌作用的有16味。對金黃色葡萄球菌抑菌較強的（MIC＜100mg/mL）中藥提取物有大力子、黃柏、黃連、香薷、黃芩、千里光、薄荷、知母、梔子、青蒿、射干共11味，其MIC范圍為3.9～62.5mg/mL；對大腸桿菌標準菌株抑菌較強的（MIC＜100mg/mL）中藥提取物有香薷、黃芩和梔子共3味，MIC值均為62.5mg/mL。

3.2 11種中草藥提取物對3株MRSA的體外抑菌作用 在32味中草藥中篩選了對金黃色葡萄球菌有較好抑菌作用的11味中草藥，分別對3株MRSA進行MIC值測定，結(jié)果見表2。與標準金黃色葡萄球菌對照組相比，除香薷外，3株MRSA對其余10味中草藥提取物表現(xiàn)出了不同程度的耐藥，其中對梔子、大力子和薄荷完全耐藥；僅黃連、射干、黃芩、黃柏、香薷5味中藥對3株MRSA同時表現(xiàn)出抑菌活性，但黃連、射干、黃柏與對照組相比，MIC值增加了2～4倍，僅香薷的MIC值減少2～4倍。

表2 11種中草藥提取物對3株MRSA的MIC值測定

4 討論

4.1 本試驗選取的32味中草藥粗提物中有24味表現(xiàn)出不同程度的體外抑菌效果，從表1統(tǒng)計結(jié)果得出，24味中藥對金黃色葡萄球菌的抑菌效果普遍優(yōu)于對大腸桿菌的抑菌效果，其中以黃連和黃柏對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，MIC值達到3.9mg/mL和15.6mg/mL。這與馬翀（2008）和田應(yīng)彪（2009）的研究結(jié)果一致。但本試驗中黃芩對金黃色葡萄球菌的抑菌效果與田應(yīng)彪的研究有一定差異，這可能是由于藥物的產(chǎn)地、提取工藝等不同造成的。金黃色葡萄球菌與大腸桿菌由于細胞膜結(jié)構(gòu)的差異，對不同種類的抗生素的敏感性也不同。這可能也是造成這兩種菌對不同中藥敏感性不同的主要原因。

4.2 挑選對金黃色葡萄球菌標準菌株MIC＜100mg/mL的11味中草藥提取物，檢測對3株MRSA的MIC值。表2結(jié)果顯示，3株MRSA對10味中藥均表現(xiàn)出一定的耐藥性，MIC值增加了2～4倍，且對梔子、大力子和薄荷完全耐藥。目前，細菌對抗生素的耐藥性引起了世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注，而本試驗發(fā)現(xiàn)MRSA對中草藥也會產(chǎn)生耐藥性。可以推測，耐藥菌的耐藥性除了具有特異性外，還具有非特異性。即對任何危害其生存的因素都有一定的抵抗力，在藥物及環(huán)境壓力的自然選擇作用下，加快了細菌的這種非特異性抵抗力的進化速度，使得這種能力越來越強，如細菌細胞膜滲透性有所改變，細菌對藥物主動外排功能增強等。這種非特異性的耐藥性將為人類防治細菌性疾病提出更大的挑戰(zhàn)。

4.3 本試驗發(fā)現(xiàn)香薷的水煎劑對MRSA的MIC較對金黃色葡萄球菌標準菌株的MIC減少2～4倍，提示該藥物對MRSA有獨特的作用機制。本試驗為下一步進行該藥物水煎劑抑菌成分的分析，作用機理研究及MRSA治療藥物的研制打下了基礎(chǔ)。

[1]陳秀樞.微量肉湯稀釋法測定MIC的評價[J].中華醫(yī)學檢驗雜志，1994，17（2）：95-98.

[2]馬翀，齊長明，王亨，等.20種中藥對奶牛乳房炎病原菌抑菌效果比較[J].中國獸醫(yī)雜志，2008，44（8）：55-57.

[3]田應(yīng)彪，陳澤慧，楊名慧，等.16種中藥水煎液對MRSA和MSSA體外抑菌試驗觀察[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2009，29（11）：897-899.