原發性高血壓患者血漿一氧化氮和紅細胞內皮型一氧化氮合酶的改變

鄭昆 馬秦嶺

(武警河南總隊衛生處 鄭州 450001)

原發性高血壓(essential hypertension)是一種常見心血管疾病,其發病與遺傳和環境因素有關,但具體發生機制尚不清楚。內源性一氧化氮(nitric oxide,NO)是由左旋精氨酸(L-Arg)在一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)的作用下產生的,是一種化學性質活躍的氣體自由基,亦是一種重要的生物信號分子。在心血管系統中,NO具有擴張血管,抑制血小板黏附和聚集,抑制血管平滑肌細胞和淋巴細胞增殖,以及影響心臟舒縮周期和收縮力等功效。研究表明,NO與高血壓發生密切相關[1]。Kleinbongard等[2]在紅細胞漿膜上發現了內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS),表明紅細胞也是心血管系統內NO的主要來源之一。本研究擬觀察原發性高血壓患者紅細胞eNOS蛋白表達量和活性,以及血漿中NO含量的變化,以探討紅細胞eNOS-NO系統在高血壓發生中的可能作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象

研究對象分為對照組和高血壓組。對照組:我院體檢正常,且無心血管疾病家族史的老人,其中男11人,女9人,年齡(59.6±7.7)歲。高血壓組:高血壓診斷標準按1999年WHO高血壓指南定義的標準確診。選擇原發性高血壓患者20例,其中男13例,女7例,年齡（62.3±8.8）歲。

1.2 血樣采集及紅細胞制備

實驗前48h內受試者均未服任何藥物。受試者于清晨(6∶30～7:30)靜臥15min,空腹,肘靜脈采血5mL。所有血液樣品均加入38g/L枸櫞酸鈉(體積比1∶9)抗凝,1400g離心10min,去上清。加入4倍體積Hank’s平衡鹽溶液(MHBSS)中反復離心3遍,清洗后取紅細胞懸浮于等體積Hank’s平衡鹽溶液中待測。

表1 各組血漿NO2-/NO3-含量、羥自由基含量及紅細胞eNOS活性比較(±s)

表1 各組血漿NO2-/NO3-含量、羥自由基含量及紅細胞eNOS活性比較(±s)

注:與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01

血漿NO2-/NO3-含量(μmol/L)紅細胞eNOS活性(U/mg)羥自由基(KU/L)對照組 88.37±5.71 39.82±4.15 192.15±22.31高血壓組 (65.30±6.95)* (25.64±4.51)** (285.40±34.46)**

1.3 血漿NO2-/NO3-含量、羥自由基含量及紅細胞eNOS活性測定

依照試劑盒(南京建成生物公司)說明,紫外分光光度計測量紅細胞eNOS活性,自動生化分析儀測定血漿NO2-/NO3-含量和羥自由基含量。

1.4 Western blot法測定紅細胞eNOS蛋白表達

制備紅細胞組織勻漿,考馬斯亮藍法測定蛋白含量。蛋白樣品經15% SDS-PAGE分離轉移于PVDF膜。一抗(Santacruz公司)孵育過夜,HRP標記二抗(TBD公司)孵育1h,ECL顯影。采用凝膠系統分析軟件掃描各條帶灰度值,以對照組運動前條帶為100%,其它各條帶與其比值,即其相對表達量(%)。Actin作為內參蛋白。

1.5 統計方法

所有數據均用SPSS 15.0統計軟件包進行處理,結果用平均數±標準差表示,各組比較采用單因素方差分析,P<0.05為顯著性水平,P<0.01為非常顯著水平。

2 研究結果

2.1 各組血漿NO2-/NO3-含量、羥自由基含量及紅細胞eNOS活性比較

高血壓組NO2-/NO3-含量和紅細胞eNOS活性均低于正常對照組,羥自由基含量高于正常對照組,且差異均具有顯著性意義,分別為P<0.05和P<0.01,見表1。

2.2 各組紅細胞eNOS蛋白表達水平變化

如圖1所示,高血壓組紅細胞eNOS蛋白表達水平相對于對照組降低了26%,差異具有顯著性意義(P<0.01)

3 討論

圖1 各組紅細胞eNOS蛋白表達水平變化

在心血管系統中,NO自由擴散到鄰近的血管平滑肌細胞內,與細胞膜上的鳥苷酸環化酶結合,使GTP轉化為cGMP,后者促進Ca2+內流,從而引起血管平滑肌舒張。NO的基礎合成對血管張力和血壓的調節具有非常重要的作用,抑制NO的合成可使健康人的血壓升高。此外,NO亦可通過cGMP途徑水平增高抑制血小板的聚集,從而抑制動脈內血栓形成及冠心病的發生[3]。本研究中,我們發現高血壓患者血漿NO2-/NO3-含量顯著低于對照組。其他研究亦發現,自發性高血壓大鼠及高血壓患者血清NO水平下降,血管舒張功能障礙[4]。這表明NO與高血壓的形成和發展有著密切的關系。高血壓患者血漿NO含量降低可能與降解增加有關。本研究中,我們發現,高血壓組血漿羥自由基水平明顯高于對照組。研究表明,高血壓患者中性粒細胞及單核細胞內的氧自由基活躍增強,而抗氧化酶活性減弱,氧自由基可與NO結合成ONOO-而直接滅活NO,使其生物活性喪失[5]。Janega等[6]研究表明,高血壓大鼠給予外源性SOD和過氧化氫酶補充,可增加NO水平,從而保護內皮細胞功能并松弛血管平滑肌。

高血壓患者NO水平降低除了與破壞增加有關,還與其生成減少有關。NOS是調節NO合成的關鍵酶,已確認有3種同工酶:神經元型(nNOS)、內皮型(eNOS)和誘導型(iNOS),它們分布的部位、生物效應及調控機制各不相同[7]。研究表明,心血管系統NO主要是由血管內皮細胞中內皮型一氧化氮合成酶(eNOS)催化合成。研究證實eNOS亦存在于紅細胞漿膜,且在正常情況下參與循環系統約30%的NO供應[2]。本研究中,高血壓組紅細胞eNOS表達量降低了26%,其活性亦降低了36%。Fischer等在體外循環中發現,高血流切應力可顯著激活紅細胞中eNOS,但高頻反復的高血流切應力可抑制eNOS的活化[8]。此外,Pistea等[9]報道,高血壓患者中的高血流切應力使紅細胞膜蛋白質的脫失與降解明顯增加,這可能與本研究中高血壓組紅細胞eNOS表達量降低有關。高血壓患者外周血管阻力增大,因而血流切應力明顯升高,從而損傷紅細胞eNOS-NO合成系統的生物學作用。NO產生減少進一步抑制血管舒張,從而繼續提高血流切應力,破壞紅細胞、血小板、內皮細胞內的NO合成系統,從而形成惡性循環,這可能是高血壓形成的一個機制。

本研究首次觀察了原發性高血壓患者紅細胞eNOS-NO合成系統變化規律,結果表明,高血壓患者血漿NO減少可能與氧自由基破壞增加以及紅細胞eNOS-NO合成系統受損有關,提示外源性補充抗氧化劑及誘導紅細胞eNOS表達可能有益于高血壓的治療。

[1]Gkaliagkousi,E,S.Douma,C.Zamboulis,et al.Nitric oxide dysfunction in vascular endothelium and platelets:role in essential hypertension[J].J Hypertens,2009,27:2310～2320.

[2]Kleinbongard,P,R.Schulz,T.Rassaf,et al.Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase[J].Blood,2006,107:2943～2951.

[3]Pilon,M,R.Wu,J.E.Huot-Marchand,et al.Effect of chronic inhibition of nitric oxide on hypertension,insulin resistance,and cardio-vascular remodeling in glucose-fed rats[J].J Cardiovasc Pharmacol,2009,53:405～413.

[4]Pechanova,O,L.Jendekova,S.Vrankova.Effect of chronic apocynin treatment on nitric oxide and reactive oxygen species production in borderline and spontaneous hypertension[J].Pharmacol Rep,2009,61:116～122.

[5]Yoshioka,H,S.Asai,M.Yoshioka,et al.Molecular mechanisms of generation for nitric oxide and reactive oxygen species,and role of the radical burst in plant immunity[J].Mol Cells,2009,47:18～26.

[6]Janega,P,S.Kojsova,L.Jendekova,et al.Indapamide-induced prevention of myocardial fibrosis in spontaneous hypertension rats is not nitric oxide-related[J].Physiol Res,2007,56:825～828.

[7]Jin,Q,T.Z.Zhang,W.M.Chen,et al.Preventive effect of endothelial nitric oxide synthase gene transfer on chronic hypoxic pulmonary hypertension in rats[J].Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue,2009,21:222～225.

[8]Fischer,U.MR.Schindler,K.Brixius,et al.Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes[J].Ann Thorac Surg,2007,84:2000～2003.

[9]Pistea,A.,E.N.Bakker,J.A.Spaan,et al.Small artery remodeling and erythrocyte deformability in L-NAME-induced hypertension:role of transglutaminases[J].J Vasc Res,2008,45:10～18.