實時熒光PCR和ELISA在乙型肝炎病毒檢測中的應用價值

屈 丹

湖南省衡陽市婦幼保健院檢驗科，湖南衡陽 421001

乙肝正在全世界蔓延，不同國家、地區的HBV的感染率強度有一定的差異,而我國屬于乙肝的高發地域,1~59歲人群中乙肝表面抗原攜帶率為7.18%,其中一定數量的乙肝病毒攜帶者能逐漸轉變為慢性肝炎,并要及時接受相關治療。如今，在熒光定量聚合酶鏈反應技術(FQ-PCR)不斷進步的情況下，其快、穩、準的特點得到了充分的發揮，此項檢測技術在臨床上已得到大面積的推廣，尤其是在HBV-DNA的檢測中顯得至關重要，而用酶聯免疫吸附技術(ELISA)在HBV標志物的檢測中只能提供病毒已侵入人體的數據,用實時熒光聚合酶鏈反應技術(PCR)則可以知道患者體內HBV的具體狀態。本次實驗同時采用FQ-PCR技術對2010年12月—2012年3月間在該院接受乙肝病毒檢測的217例血清標本進行 HBV-DNA檢測和ELISA技術進行HBVM檢測，最后比較結果并進行討論。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取患者血清標本217例，并同時采用FQ-PCR技術對217例血清標本進行HBV-DNA檢測和ELISA技術進行HBV-M檢測。

1.2 儀器與試劑

ELISA試劑盒；HBV-DNA的FQ-PCR試劑。B10680酶標儀；ROTOR GENE 3000實時熒光定量PCR儀。

1.3 方法

HBV-M檢測使用ELISA技術，實驗操作與結果的判斷依照試劑說明書進行。HBV-DNA檢測使用FQ-PCR技術，實時熒光法檢測核酸的擴增，實驗操作依照試劑盒說明書進行。

1.4 統計方法

實驗結果采用χ2檢驗進行判定。

2 結果

217例標本由上述兩種技術同時進行測定,由PCR技術檢測出的陽性率與ELISA技術檢測出的陽性率之間比較，差異有統計學意義（P<0.05）；而 HBV-DNA陽性拷貝數與 ELISA技術檢測出的“大三陽”和“小三陽”兩組之間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。 見表 1。

表1 ELISA檢測HBV-M和FQ-PCR檢測HBV-DNA的結果

3 討論

對于乙肝病毒的診斷主要是依靠血清特異性抗原、抗體與HBV-DNA的檢測,而運用ELISA技術檢測HBV-M則是診斷患者是否感染HBV的傳統方法,它可以檢測出人體的免疫系統對HBV的具體反應情況。PCR技術可以檢測乙肝患者血清中HBV-DNA的拷貝狀態,反映患者的病理狀況,其提供的信息具有很高的參考價值，能在治療過程中起到至關重要的作用，幫助醫生選擇治療方案。FQ-PCR是在完全閉管的情況下進行檢測,沒有必要進行PCR的后處理,這樣能很好的避免交叉感染,同時運用實時檢測技術持續監測在PCR中的反應系統對熒光信號變化的反應情況,而熒光信號在某個閾值附近的循環周期和模板DNA的起始數量的對數值遵循一定的線性關系,根據該線性關系可以準確定量起始模板,且此種定量法的準確率高,能客觀地反應出HBV的復制狀態[1]。

該實驗用HBV-DNA的FQ-PCR檢測217例不同的乙肝病毒陽性血清標本后,結果顯示HBV-DNA在不同類型的HBV-M陽性標本中，甚至是全陰性標本中都可以檢測出來,可是其檢出率之間卻有一定的差距,該結果提醒我們不能單單依據HBV的血清學檢查結果來判定患者攜帶的病毒是否有傳染性[2]。有些患者處于“窗口”期，就是所謂的病毒感染早期,病毒的擴增僅僅限于部分人體組織中，如肝、淋巴等,而血液中極少含有病毒,故用ELISA檢測HBV-M過程中的靈敏度、準確度較低,導致HBV的血清學檢測結果表現為全陰性。故用HBV-DNA方法對獻血人員的篩查就顯得非常重要。

該實驗從 109例 HBsAg、HBeAg、HBcAb陽性組患者中，檢測出10例陰性的血清HBV-DNA,而某些文獻曾有“大三陽”組患者的HBV-DNA陽性檢出率為100%的結論，該實驗結果與該結論有些許偏差，故并非所有“大三陽”患者都有傳播乙肝病毒的能力。造成此種現象的原因可能是乙肝病毒在肝細胞DNA中與抗原基因進行全基因整合或表達，在肝細胞內部只有抗原的表達而無病毒的擴增,所以能在血清中檢測出各種類型的HBV抗原,但乙肝病毒卻沒有在血清中出現，造成了部分HBsAg、HBeAb、HBcAb陽性組患者的HBV-DNA檢測為陰性的現象,而在同種情況下，“小三陽”組的發生率(61.3%)要比“大三陽”組的發生率(9.2%)高出許多(P=0.024),雖然這些患者沒有傳播乙肝病毒的能力,但也不能說明患者已經痊愈,有可能身體的某些組織發生病變，導致機體受損、免疫力降低等情況下，乙肝病毒很有可能會重新擴增,使患者轉變成傳染源,故對該類型的患者需要進行復查[3]。在“小三陽”組的標本中HBV-DNA拷貝數>105的占HBV-DNA陽性組的20.8%,“大三陽”組卻占到了81.8%,明顯高出“小三陽”組(P<0.01),與國內一些文獻的結論相比無太大的出入。除此之外,HBeAg陽性組的HBV-DNA檢出率要大大高于HBeAg陰性組 (P<0.05)，從此結果可以知道檢測HBeAg陰轉與抗-HBe并不代表患者已經失去傳染能力，只是傳染性變小,有些患者體內依然存在HBV擴增的可能,此種情況可屬于前c區突變。這種突變將使HBeAg不能繼續產生,但HBV的擴增受其影響較小,此類患者應繼續進行抗病毒的治療。

4 結語

由上述研究可以看出,在判斷乙肝患者傳染性強弱方面上,HBV-DNA檢測能力要高于血清學的檢測指標,但血清學的檢測指標在分析HBV感染、病理狀況或HBV-DNA的陰性結果但不能排除患者攜帶HBV的情況下,沒有其他的檢測方法能夠代替它。ELISA法是臨床診斷 HBV的傳統方法，具有易操作、成本低的特點，它可以檢測出人體的免疫系統對HBV的具體反應情況，僅僅可以進行定性分析，而不能進行病毒的定量分析，故PCR定量檢測優勢較大，值得我們大力推廣。

[1]谷香珍，張敬黨，王霞，等.乙肝免疫學檢測與 HBV-DNA的血清學檢測分析[J].現代預防醫學，2006，33（3）：383.

[2]張蓓，楊曉云，劉蕊，等.熒光定量 PCR檢測 HBV-DNA與乙肝兩對半檢測結果的相關性討論[J].河北醫學，2006，12(9)：835-838.

[3]李金明.實時熒光 PCR技術[M].北京：人民軍醫出版社，2009：190.