固相萃取-高效液相色譜法測定葛根中葛根素含量

蒲艷春，吳方評，楊宏健

葛根為豆科植物野葛 Pueraria loata(Willd.)Ohwi的干燥根，習稱野葛，在湖南西部、貴州等地分布極其廣泛，用于外感發熱、頭痛等癥。現代研究證實，葛根中的主要有效成分為葛根素、大豆苷、大豆苷元等異黃酮類化合物，具有抗炎解熱、擴張冠狀動脈、增加冠狀動脈血流量的作用，同時也有降低血壓的作用[1]。有關葛根素的測定研究已有不少的報道。2010年版《中國藥典(一部)》采用高效液相色譜法對葛根素含量進行測定[2]，但在具體操作過程中葛根素與其他物質吸收峰分離較差。本試驗中通過固相萃取小柱預富集，30%的甲醇10 mL洗脫去雜，再用無水乙醇5 mL對固相萃取小柱進行洗脫，用高效液相色譜法對葛根素進行測定，方法的分離度和重現性較好，特別是用C18固相萃取小柱對樣品進行富集和除雜尚屬首次。該方法可用于葛根中葛根素的分離測定，現報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括單泵、可變波長檢測器、Agilent漢化版色譜工作站、7725i手動進樣閥;SK2200H型超聲清洗儀(上海科導超聲儀器有限公司);FA1004型電子分析天平(上海精密科學儀器廠);Sep－Park－C18固相萃取小柱(Waters公司)，Unic4802型紫外－可見分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司)。葛根素(中國藥品生物制品檢定所，批號為110752－200912，供含量測定用);葛根購于湖南懷化懷仁大藥房，采收于2009年11月;水為2次蒸餾水;甲醇(天津市科密歐化學試劑有限公司)為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

精確稱取葛根素對照品0.005 0 g，用5 mL的甲醇溶解，再用2次重蒸水定容至50 mL，即得0.100 0 g/L的葛根素對照品溶液。取少量葛根粉，過三號篩，精密稱取0.10 g，置具塞錐形瓶中，加入30%的乙醇水溶液50 mL，超聲提取30 min，過濾，提取液水浴蒸至無醇味，加入5 mL甲醇，振搖，轉入50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度;取25 mL樣品溶液，以5 mL/min的流速過預處理的Sep－Park－C18固相萃取小柱，先用30%的甲醇溶液10 mL洗脫除雜，再用5 mL無水乙醇以1 mL/min的流速洗脫，棄去最初的1 mL;水浴揮去乙醇，用流動相溶解并定容至5 mL，作為供試品溶液。

2.2 色譜條件與試驗適用性試驗

色譜柱:Agilent Eclipse XDB－C18柱(150 mm×4.6 mm，5μm);流動相:甲醇－水(25∶75);流速:0.5 mL/min;檢測波長:251 nm;進樣量:20μL。在上述條件下的色譜圖見圖1。可見，葛根素的保留時間為2.910 min，且分離度較好。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 方法學考察

線性關系考察:分別精密量取 0.1，0.1，0.2，0.4，0.8 mL 質量濃度為0.100 0 g/L的葛根素對照品溶液，用2次蒸餾水分別定容至 100，50，50，50，50 mL，分別得質量濃度為 0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 μg/mL 的系列溶液，過 C18固相萃取小柱，乙醇洗脫，揮去乙醇，用流動相分別定容至 10，5，5，5，5 mL，依法進樣。以對照品峰面積為縱坐標、質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，回歸方程為 A=3 987.28C －32.14，r=0.999 3(n=5)。結果表明，葛根中葛根素用C18固相萃取小柱富集后含量在0.1～1.6μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

精密度試驗:取質量濃度為1.6μg/mL的對照品溶液25 mL，用C18固相萃取小柱富集至5 mL，依法重復進樣5次。結果峰面積的 RSD為0.93%。

重復性試驗:取同一批樣品粉末5份，每份0.2 g，依法制備供試品溶液并進樣測定。結果含量的 RSD為0.97%。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，分別于 0，1，2，3，4，6，8 h時依法進樣。結果葛根素含量的 RSD為0.79%。

加樣回收試驗:精確稱取6批已知含量的葛根粉末0.01 g，每兩份為1組，分別加入葛根素對照品適量，按供試品溶液制備方法處理，依法測定含量，計算回收率。結果見表1。

表1 葛根素加樣回收試驗結果(n=6)

2.4 樣品含量測定

精確稱取不同批次的樣品各5份，按供試品溶液制備方法進行樣品處理，并按2.2項下條件進樣，用外標法計算葛根中葛根素的含量。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果(n=5)

3 討論

葛根素的提取可用加熱回流、微波輔助提取和超聲提取等方法，考慮到提取效率和提取率，本試驗采用了超聲提取法，并試驗了不同的提取時間，結果在150 W功率下，超聲提取30 min可基本把葛根素提取完全。

由于乙醇對C18固相萃取材料的洗脫強度較大，葛根素在C18固相萃取小柱上不能保留，因此本試驗通過除去乙醇，再改用低濃度甲醇溶液對樣品進行溶解，保證葛根素在C18固相萃取小柱上能充分地得到保留。洗脫除雜時試驗了不同濃度的甲醇對葛根素的洗脫情況，當甲醇濃度低于30%時，葛根素在固相萃取小柱上能較好保留，故用30%的甲醇對固相萃取小柱進行洗脫除去大部分的干擾雜質，再用5 mL無水乙醇對葛根素進行洗脫。

[1]章育中，楊 凡.高效液相色譜法測定葛根及其片劑中異黃酮的含量[J].藥物分析雜志，1984，4(2):67.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:312.