高效液相色譜法同時測定盆炎凈片中原兒茶酸、咖啡酸和芍藥苷含量

黎 強 ，張曉娟 ，羅 玲

盆炎凈片由忍冬藤、狗脊、蒲公英、益母草、車前草、川芎、赤芍、雞血藤8味中藥組方，具有清熱利濕、利血通絡、調經止帶功效[1]。方中忍冬藤清熱解毒，疏風通絡;雞血藤主要補血，活血通絡;狗脊補肝腎，強腰膝;益母草活血調經，利尿消腫;川芎活血行氣，祛風止痛;赤芍清熱涼血，散瘀止痛。原標準僅選取忍冬藤及赤勺作為定性指標，赤勺中芍藥苷作為定量指標。有學者增加雞血藤、益母草、川芎的鑒別作為定性指標，增加忍冬藤中綠原酸的含量測定，提高了盆炎凈片的質量控制要求[2]。為更全面地控制藥品質量，本試驗中擬用高效液相色譜(HPLC)法同時測定盆炎凈片中原兒茶酸、咖啡酸、芍藥苷的含量，現報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型Series高效液相色譜儀(四元泵，在線脫氣機，自動進樣器，柱溫箱);TU－1221型紫外可見分光光度計(北京普析通用);AE240型電子分析天平(梅特勒－托利多);SB2200型超聲清洗器(上海必能信超聲有限公司)。乙腈、磷酸(色譜純)，純凈水(杭州娃哈哈集團);原兒茶酸對照品(批號為809－200102)，咖啡酸對照品(批號為110885－200102)，芍藥苷對照品(批號為110736－200934，含量95.7%)，均購于中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用;盆炎凈片(陜西白鹿制藥股份有限公司);忍冬藤、雞血藤、蒲公英、狗脊、川芎、益母草、車前草、赤勺等8味藥材均為市售品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱:Agilent Eclipse XDB－C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流動相:乙腈－0.1%磷酸梯度洗脫，0～10 min時乙腈 8%和0.1%磷酸 92%，10～25 min時乙腈 14%和 0.1%磷酸 86%;流速:0.8 mL/min;檢測波長:219 nm;進樣量:10 μL。在此條件下，3個組分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數按原兒茶酸、咖啡酸、芍藥苷計均大于5 000(圖1)。

2.2 溶液制備

取盆炎凈片10片，研細，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入15 mL甲醇，稱定質量，超聲處理20 min，放冷，用甲醇補足質量，搖勻，過濾，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。精密稱取原兒茶酸、咖啡酸和芍藥苷對照品適量，以甲醇為溶劑分別制成質量濃度為 1.4，1.4，0.6 g/L 的貯備液，并制備含原兒茶酸28μg/mL、咖啡酸28μg/mL和芍藥苷120μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗:按處方制備分別不含雞血藤、蒲公英及赤勺原藥材的樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照品溶液，依法進樣。結果分別在原兒茶酸、咖啡酸和芍藥苷的對應峰位上未出現色譜峰，說明陰性對照品溶液對測定無干擾(見圖1)。

線性關系考察:分別精密吸取對照品貯備液，采用等量遞減方法制得系列質量濃度的混合對照品溶液，進樣分析，記錄色譜峰面積，以對照品質量濃度(X)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線。結果見表1。

精密度試驗:將同一混合對照品溶液在上述色譜條件下重復進樣5次。結果原兒茶酸、咖啡酸和芍藥苷峰面積的 RSD分別為0.7% ，0.4%，0.5%。

圖1 高效液相色譜圖

表1 線性關系考察結果

穩定性試驗:取同一供試品溶液，分別在 0，2，4，8，12 h時按上述色譜條件進行測定。結果原兒茶酸、咖啡酸和芍藥苷峰面積的 RSD分別為0.8%，1.8%，1.0%，表明供試品溶液至少在12 h內穩定。

重復性試驗:取同一批樣品(批號為100306)，依法平行制備6份供試品溶液并進樣分析。結果原兒茶酸、咖啡酸和芍藥苷含量平均值為 1.605 9，1.556 9，3.655 2 mg/g，RSD 分別為 1.2%，1.4% ，1.0%。

加樣回收試驗:分別取已知含量的樣品(批號為100306)6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別精密加入對照品貯備液，揮干溶劑后按供試品溶液制備方法制備溶液并測定各成分的含量，計算回收率。結果見表2。

表2 原兒茶酸、咖啡酸、芍藥苷加樣回收試驗結果(n=6)

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液并進樣測定，以外標法計算含量。結果見表3。

表3 樣品含量測定結果(mg/g)

3 討論

將適當質量濃度的原兒茶酸、咖啡酸和芍藥苷對照品溶液在200～400 nm波長范圍內進行吸收光譜掃描，結果原兒茶酸在259 nm和219 nm波長處有最大吸收，咖啡酸在323 nm和219 nm波長處有最大吸收，芍藥苷在229 nm波長處有最大吸收，經綜合考量，最后確定測定波長為219 nm。

因本試驗中成分靠近末端吸收，在色譜條件篩選試驗中，比較乙腈－水、乙腈－1%磷酸、乙腈－0.1%磷酸溶液3個流動相后，確定乙腈－0.1%磷酸為最終條件。當進樣量為20μL時，樣品過載，峰形嚴重前沿，而調整進樣量為10μL后，則樣品峰形尖銳，對稱性良好。

考察使用溶劑時，曾采用甲醇、50%甲醇、乙醇對樣品進行提取，結果甲醇的提取效率最高;后通過超聲15，20，30 min，回流1，1.5 h，振蕩等提取方法比較，得出用甲醇超聲提取20 min時提取效果最好，基線相對較平[5－6]。

含量測定中，不同批號樣品間咖啡酸含量差別較大。而咖啡酸會與奎尼酸反應生成綠原酸[7]，是否因此原因導致咖啡酸含量不穩定，仍需要進一步驗證。

[1]YBZ25272005，國家食品藥品監督管理局標準(試行)[S].

[2]楊遁嘉，霍 昕，劉文煒，等.雞血藤顆粒質量標準的研究[J].中成藥，2009，3(1):144 －146.

[3]尹 偉，岳春華，雷 偉，等.盆炎凈片的質量控制[J].中南藥學，2007，5(3):246 － 149.

[4]錢正明，李會軍，李 萍.高效液相色譜法測定忍冬藤和葉中8種活性成分[J].分析化學，2007，8(35):1 159 －1 163.

[5]鄧君麗，王兆霞.HPLC測定消炎片中咖啡酸的含量[J].中成藥，2007，29(4):615 －616.

[6]耿家玲，盂 芹.HPLC法測定燈盞細辛中綠原酸和咖啡酸的含量[J].中國藥師，2010，13(5):701 －702.

[7]孟 偉，溫亞男，魏永巨，等.金銀花中綠原酸含量的熒光法測定[J].分析化學，2009，37(A01):211.