反相高效液相色譜法測定抑毒調肝合劑中丹參素鈉含量＊

羅宏麗，馮碧敏，肖順林

抑毒調肝合劑是由丹參、黃精、黨參、貫仲、虎杖5味中藥經水煮醇沉制成的中藥復方制劑，服用方便，具有補氣、解毒、調肝、健脾的作用，臨床用于治療癥見疲乏無力、不思飲食、肝區隱痛、自汗的慢性肝炎患者。方中丹參為主藥，丹參素鈉為其主要有效成分之一，該制劑現行質量標準無含量測定項。為了更好地控制制劑的內在質量，筆者采用反相高效液相色譜(RP－HPLC)法測定了抑毒調肝合劑中丹參素鈉的含量，現報道如下。

1 儀器與試藥

Dionex Ultimate 3000型高效液相色譜儀(美國戴安公司);Kromasystem 2000色譜工作站(Bio.Tek Instrument Snl公司);Hamiltn ASO－0023型液相色譜進樣器;AE240型電子天平(瑞士Mettler公司);AS10200型超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。丹參素鈉對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110855－200809);抑毒調肝合劑(瀘州醫學院附屬醫院自制，批號為101004，101027，101105);甲醇為色譜純，水為濾過的蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱:Hypersil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5μm);流動相:乙腈 － 甲醇 －水 －冰醋酸(0.5∶8∶92∶1);流速:1.0 mL/min;檢測波長:280 nm;柱溫:30℃;進樣量20μL。理論塔板數以丹參素鈉計算不低于2 000。在此條件下，丹參素鈉色譜峰與相鄰干擾峰完全分離(見圖1)。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

稱取丹參素鈉對照品8.13 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得質量濃度為0.813 g/L的丹參素鈉對照品溶液。精密量取抑毒調肝合劑100μL，置10 mL離心管，吹干，精密加入甲醇100μL，振蕩，離心，即得供試品溶液。取不含丹參的方中各藥料，按抑毒調肝合劑生產工藝制備丹參素鈉陰性對照樣品，取適量，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

線性關系考察:精密吸取丹參素鈉對照品溶液2，4，6，8，10 mL，分別置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成質量濃度依次為 32.52，65.04，97.56，130.08，162.60 μg/mL 的系列標準曲線溶液，搖勻，按上述色譜條件分別進樣20μL，測定峰面積。以峰面積(A)為縱坐標、標準曲線溶液質量濃度(C)為橫坐標繪制標準曲線，計算得回歸方程 A=0.261 1C+1.816，r=0.991 4(n=5)。結果表明，丹參素鈉質量濃度在 32.52～162.60μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗:精密吸取同一質量濃度的對照品溶液(97.56μg/mL)20μL，按上述色譜條件重復進樣6次，記錄色譜圖。結果的 RSD為0.97%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，在室溫條件下分別于0，2，4，6，8，10，12 h 時進樣 20 μL，記錄峰面積。結果的 RSD 為1.43%(n=7)，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

重復性試驗:取同一批(批號為101004)樣品適量，共6份，依法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣，記錄峰面積。結果丹參素鈉的平均含量為 91.63 μg/mL，RSD 為 1.12%(n=6)，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗:精密量取已知含量的樣品適量，置試管中，再分別精密加入低、中、高不同質量濃度的丹參素鈉對照品溶液，按供試品溶液制備方法制備溶液并依法進樣測定，計算加樣回收率。結果見表1。

表1 丹參素鈉加樣回收試驗結果(n=9)

2.4 樣品含量測定

取樣品3支，混勻，精密量取，依法制備供試品溶液，按擬訂的色譜條件測定含量。結果批號為101004，101027，101105的樣品中丹參素鈉含量分別為 91.62，91.59，91.63 μg/mL(n=3)。

3 討論

丹參是唇形科植物丹參的干燥根莖，為2010年版《中國藥典(一部)》收載的常用中藥之一，味苦，性微寒，入心、肝經，具有活血化瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消癰之功，為方中主藥。其化學成分分為脂溶性成分和水溶性成分，其中水溶性部分丹參素鈉已被證實具有明顯抑制肝癌細胞生長、阻止肝細胞硫代乙酰胺損傷和促進肝細胞增生等作用[1－2]。因此本研究中將丹參素鈉作為抑毒調肝合劑含量測定的指標性成分之一。

取丹參素鈉對照品溶液，在200～400 nm波長范圍進行紫外掃描，發現在280 nm波長處有最大吸收，故選其為檢測波長。在試驗過程中，比較了不同體系和不同比例的流動相對主峰的保留時間、峰形和分離度的影響，結果以乙腈－甲醇－水－冰醋酸(0.5∶8∶92∶1)的分離效果最好，故選其作為流動相。還發現柱溫對丹參素鈉分離測定影響較大，25℃時主峰的保留時間過長，柱溫過高其分離度不好，當柱溫選擇30℃時結果滿意[3－4]。

采用反相高效液相色譜法測定制劑中丹參素鈉含量，方法學考察結果表明，方法精密度、穩定性、加樣回收率和重復性均能滿足定量的要求。故該方法可用于抑毒調肝合劑的質量控制，建議其質量標準升級時增加丹參素鈉的含量測定。

[1]吳映雅，譚宇蕙，寧異真，等.丹參素鈉對大鼠肝癌細胞及自殺基因旁觀者效應的影響[J].中藥藥理與臨床，2007，23(5):52－54.

[2]李躍華，李 菁，戚曉紅，等.丹參素和肝細胞生長因子對藥物性肝細胞損傷的影響[J].中西醫結合肝病雜志，1998，8(3):153－155.

[3]王 梅，楊 華.HPLC法測定防癱丸中丹參素鈉的含量[J].中醫研究，2010，23(8):21－23.

[4]黃蘭芷，付超美，胡慧玲，等.HPLC法測定抗癌顆粒中丹參素鈉的含量[J].成都中醫藥大學學報，2006，29(2):53－55.