Adv-shRNA抑制NRP2表達對胃癌SGC7901細胞增殖的影響

毛 東 付曉光 陸 航

(遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院胃腸外科，遼寧 錦州 121001)

胃癌的預后與癌組織浸潤深度及是否發(fā)生了淋巴結轉移 相關〔1〕。研究顯示，腫瘤相關淋巴管的形成能夠促進腫瘤的轉移擴散〔2〕。因此當前有很多研究關注于如何抑制腫瘤環(huán)境下淋巴管的形成。VEGFR3是最先被驗證的淋巴管生成的特異性標記物。VEGFR3是淋巴管內皮生長刺激因子VEGFC的特異性受體。VEGFC與VEGFR3結合后可引起淋巴管內皮細胞增殖、遷移及抑制內皮細胞凋亡，從而發(fā)揮促進淋巴管新生的作用。神經纖毛蛋白(NRPs)是一種跨膜糖蛋白，目前研究證明NRPs在腫瘤的生長轉移中起著至關重要的作用〔3〕。最新研究表明NRP2參與了VEGFC誘導的淋巴管內皮細胞遷移和淋巴管新生(特別是與腫瘤相關的淋巴管功能性新生)功能，在腫瘤動物模型中阻斷NRP2功能發(fā)現腫瘤轉移至哨兵淋巴結和遠隔器官減少的現象〔4〕。本實驗將構建重組腺病毒載體介導的NRP2-shRNA基因沉默載體，轉染胃癌細胞株SGC7901后檢測該細胞中NRP2的表達情況以及NRP2-shRNA轉染前后對于抑制SGC7901細胞的增殖、侵襲遷移的能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 胃癌細胞株SGC7901購自中國協和細胞庫;RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自Gibco公司;Trizol試劑、RT-PCR試劑盒、Marker、限制性內切酶等均購自TaKaRa公司;Lipofectamine 2000、OPTI-MEM等購自Invitrogen公司;兔抗人NRP2單克隆抗體、二抗、β-actin內參照購自Santa Cruz公司;超純質粒提取試劑盒、質粒小提試劑盒購自QIAGEN公司;RNAi干擾序列以及引物序列設計、合成由賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司完成，并統(tǒng)一構建到重組腺病毒系統(tǒng)pAdEasy-1上，同時攜帶GFP作為熒光示蹤標記物，-80℃保存;干擾序列及分組見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組腺病毒載體轉染胃癌細胞株SGC7901 胃癌細胞株SCG7901接種于6孔細胞培養(yǎng)板上，常規(guī)培養(yǎng)24 h，分別轉染上述4種腺病毒液，37℃培養(yǎng)1 h后，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，熒光顯微鏡下觀察，以不引起明顯細胞病變效應(CPE)的最大MOI作為最佳MOI值，并以最佳MOI值再次進行轉染。

1.2.2 RT-PCR測定轉染NRP2-shRNA沉默效率 細胞轉染72 h后，根據TRizol法提取總RNA，電泳驗證。按照按照RTPCR二步法試劑盒說明書進行操作，之后進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，凝膠成像系統(tǒng)統(tǒng)計各條帶OD值，計算沉默效率，篩選出效率較高的片段。實驗重復三次取平均值。

1.2.3 MTT法測定細胞增殖情況 胃癌細胞SGC7901處于對數生長期時制成細胞懸液，以密度為1×104/孔接種到96孔板，37℃、5%CO2濃度常規(guī)培養(yǎng)，待細胞貼壁后，分別加入含上述效率最高的NRP2-shRNA腺病毒液的培養(yǎng)基和空白培養(yǎng)液，于轉染后72 h加入5 mg/ml的MTT溶液每孔10 ml，溫箱孵育4 h后棄上清，每孔加入DMSO 150μl震蕩10 min，使結晶充分溶解后用酶標儀測定490 nm波長的OD值，以無細胞的空白孔調零，實驗重復三次取平均值。

1.2.4 Western印跡測定SGC7901細胞轉染后NRP2蛋白表達效率 取轉染腺病毒72 h的SGC7901細胞，4℃預冷的PBS沖洗3次后加入含1%PMSF的裂解液400μl，置于冰上裂解30 min，4℃離心12 000 r/min×5 min，取上清。采用BCA法計算蛋白濃度。蛋白與上樣緩沖液以 3∶1比例混合，加入10μl/mlβ-巰基乙醇，煮沸5 min。配置8%分離膠、5%濃縮膠后進行SDS-PAGE電泳后，轉膜至PVDF膜上，放置保鮮袋內加入1∶500稀釋濃度的一抗4℃過夜，加入二抗室溫孵育1 h，用TBST洗滌PVDF膜，BCIP/NBT染色工作液進行顯色反應，凝膠成像系統(tǒng)分析目的條帶及內參照，實驗重復三次取平均OD值。

1.3 統(tǒng)計學方法 數據用SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計學處理，計量資料用x±s表示，采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 腺病毒液轉染胃癌細胞株SGC7901情況 胃癌細胞株SGC7901正常培養(yǎng)生長匯合至70%可見細胞成梭形貼壁生長，分布均勻，胞漿飽滿;經腺病毒介導的NRP2-shRNA沉默片段轉染SGC7901 72 h后發(fā)現有大量綠色熒光表達而未見明顯CPE現象。見圖1。

圖1 SCG7901細胞生長情況

2.2 RT-PCR檢測結果 轉染腺病毒液72 h后RT-PCR產物電泳結果顯示各組內參β-actin條帶亮度相似，各重組腺病毒轉染組NRP2 mRNA水平低于陰性轉染組和空白對照組(圖2)，3種病毒液與陰性對照和空白對照組相比均存在顯著性差異(P＜0.05)，表明3種病毒液均不同程度下調NRP2基因mRNA的表達，其中以載體NRP2-shRNA-3(C組)抑制效應最強，與A組和B組相比，有顯著性差異(P＜0.05)。見表2。

表2 各組NRP2 mRNA相對OD值表達情況(x ± s，n=3)

2.3 MTT檢測SGC7901細胞增殖情況 陰性對照組與空白組細胞生長迅速，兩組間無顯著差異(P＞0.05)，實驗組(C組)經腺病毒載體轉染后細胞增殖程度顯著減少，與前兩組相比有顯著性差異(P＜0.05)。見表3。

表3 MTT法檢測三組細胞不同時間點的OD值

圖2 RT-PCR檢測各組NRP2 mRNA表達情況

2.4 Western印跡測定NRP2蛋白表達量 陰性對照組(D組)與空白組(E組)NRP2蛋白相對OD值分別為0.77±0.15和0.82±0.10，明顯高于實驗組(C組)的0.14±0.01，有顯著性差異(P＜0.01)，而D組與E組之間無顯著性差異(圖3，P ＞0.05)。

圖3 Western印跡檢測各組NRP2蛋白表達情況

3 討論

NRPs是一種跨膜糖蛋白，最初是作為軸突導向分子Semaphorin的受體而發(fā)現，在神經細胞的導向中發(fā)揮重要調節(jié)作用，進一步研究證明NRP2在血管的生成、發(fā)育及腫瘤的生長轉移中也起著關鍵的作用〔5，6〕，給我們胃癌的基因治療方面提供了新的思路。

在本項實驗中我們選取SGC7901細胞作為實驗的研究對象。采用RNAi干擾技術抑制胃癌細胞SGC7901 NRP2基因的表達。由于siRNA在體內的半衰期短，對基因的抑制作用較短暫，為了能夠較長時間抑制NRP2基因，我們采用構建shRNA腺病毒表達載體來沉默NRP2基因，重組載體轉染進細胞后通過RNA聚合酶Ⅲ啟動子轉錄互補DNA序列，從而在體內合成shRNA，合成的shRNA在Dicer酶的作用下環(huán)狀區(qū)域斷裂形成雙鏈siRNA，進而產生干擾效應。由于shRNA腺病毒表達載體可在體內持續(xù)產生siRNA，因此，可達到長時間沉默NRP2基因的作用。另外，本實驗通過阻斷SGC7901細胞中NRP2基因的作用抑制了癌細胞的增殖生長和淋巴轉移。在實驗中我們通過RT-PCR、MTT、Western印跡方法分別檢測了SGC7901細胞中NRP2基因的mRNA和蛋白的表達情況以及癌細胞增殖情況，結果表明攜帶有GFP的腺病毒表達載體轉染胃癌細胞SGC7901成功，且轉染效率較高，重組腺病毒載體轉染胃癌細胞SGC7901導致NRP2基因的mRNA和蛋白表達降低，說明腺病毒載體可以抑制胃癌細胞SGC7901中的NRP2基因的mRNA表達及轉錄后的蛋白表達，NRP2-shRNA腺病毒載體具有抑制SGC7901細胞增殖的作用。

綜上所述，我們成功的利用重組腺病毒載體抑制了NRP2基因在胃癌細胞SGC7901中的表達，為下一步動物模型體內實驗提供理論基礎和前期準備。

1 陳 涼，李 濤.胃癌綜合治療現狀與進展〔J〕.世界華人消化雜志，2008;16(6):571-4.

2 Quante M，Raskopf E，Stahl S，et al.No functional and transductional significance of specific neuropilin 1 siRNA inhibition in colon carcinoma cell lines lacking VEGF receptor 2〔J〕.Oncol Rep，2009;21(5):1161-8.

3 Geretti E，van Meeteren LA，Shimizu A，et al.A mutated soluble neuropilin-2 B domain antagonizes vascular endothelial growth factor bioactivity and inhibits tumor progression〔J〕.Mol Cancer Res，2010;8(8):1063-73.

4 Rizzolio S，Tamagnone L.Multifaceted role of neuropilins in cancer〔J〕.Curr Med Chem，2011;18(23):356375.

5 Caunt M，Mak J，Liang WC，et al.Blocking neuropilin-2 function inhibits tumor cell metastasis〔J〕.Cancer Cell，2008;13(4):331-42.

6 Cai Y，Wang R，Zhao YF，et al.Expression of Neuropilin-2 in salivary adenoid cystic carcinoma:its implication in tumor progression and angiogenesis〔J〕.Pathol Res Pract，2010;206(12):793-9.