肌肽對過氧化氫誘導PC12細胞損傷后NF-κB P65表達的影響

董曉麗 明海霞 金 戈

(甘肅中醫學院生理學教研室，蘭州 甘肅 730000)

肌肽是繼超氧化物歧化酶(SOD)和維生素E后又一被發現的天然非酶促自由基清除劑和抗氧化劑〔1〕。本研究用H2O2處理PC12細胞，制備氧化應激損傷致凋亡的模型，采用MTT法檢測肌肽對PC12細胞增殖的影響，觀察肌肽是否具有抗氧化應激的神經保護作用;檢測肌肽對凋亡相關基因NF-κB P65 mRNA和蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠腎上嗜鉻細胞瘤細胞(PC12細胞)購于上海中科院生物細胞所;引物設計參考文獻〔2〕，委托上海生工合成。L-肌肽購自吉爾生化(上海)有限公司、UNIQ-10 Trizol總RNA抽提試劑盒和AMV一步法RT-PCR試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司;小鼠抗大鼠NF-κB P65單克隆抗體、SABC、DAB試劑盒等購自武漢博士德生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 PC12細胞經常規傳代培養，培養基采用DMEM培養液，含10%熱滅活超級新生牛血清、1%谷氨酰胺、青鏈霉素(100 U/ml)。37℃、5%CO2，飽和濕度下恒溫培養箱中貼壁生長，每3天換液1次，1 w傳代1次。

1.2.2 MTT比色法檢測PC12細胞的增殖 取對數生長期的PC12細胞，制成單細胞懸液，按照1×104個/ml的密度接種于96孔板中，每組6孔，37℃孵育過夜后，棄去原培養液，正常組加入 DMEM完全培養基 100μl，損傷組加入終濃度為200μmol/L的H2O2，保護組加入H2O2前30 min加入肌肽，使肌肽終濃度分別為10，20，30 mmol/L。37℃孵育16 h，棄去藥液和培養液，每孔加入MTT 25μl，繼續孵育4 h，小心吸去上清液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μl，振蕩10 min，用酶聯免疫分析儀490 nm波長檢測各孔光密度(OD)值，并計算生長抑制率。根據實驗結果選擇肌肽作用PC12細胞的最佳濃度。

1.2.3 RT-PCR檢測NF-κB P65 mRNA的表達 將所需離心管、PCR反應管和微量吸頭在0.1%EPC溶液中浸泡24 h，烤干后高壓滅菌備用。RNA抽提按照UN IQ210 Trizol總RNA抽提試劑盒說明書進行。RT-PCR引物設計參照文獻〔2〕:擴增產物擴增產物493 bp。RT-PCR反應按試劑盒說明操作。擴增產物保存于4℃冰箱，取擴增產物于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 SABC免疫酶染色法測定NF-κB P65蛋白的表達 取對數生長期細胞制成單細胞懸液，接種于預先放置6 mm×22 mm蓋玻片的六孔板中，培養過夜。棄原培養液，設正常對照組、損傷組(加入終濃度為200μmol/L的H2O2)、保護組(加入H2O2前30 min加入肌肽終濃度為20 mmol/L)和空白對照組，繼續培養16 h，取出蓋玻片，按照SABC試劑盒說明書操作。

1.2.5 Annexin V2FITC和PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡調整細胞計數為1×106個/ml接種于T250培養瓶中，設正常對照組、損傷組、保護組(加入H2O2前30 min加入肌肽終濃度為20 mmol/L)和空白對照組，培養24 h，棄液，加入DMEM繼續培養16 h，用PBS重懸細胞，離心5 min，棄上清，重復2次，將細胞重懸于200μl結合緩沖液。加入10μl Annexin V2FITC和5μl PI，輕輕混勻，避光室溫反應15 min，加入300μl結合緩沖液，立即上機檢測。記錄激發光波波長為488 nm處的熒光。

1.3 統計學處理 數據均用x±s表示，采用SPSS10.0軟件包處理，根據方差齊性檢驗結果，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗或Mann-Whitney U檢驗。多組間比較采用單因素方差分析或Kruskal-Wallis H檢驗。

2 結果

2.1 肌肽對過氧化氫的毒性有保護作用 培養的PC12細胞用不同的劑量(10～30 mmol/L)的肌肽預處理30 min，加入200μmol/L的H2O2，PC12細胞的存活率隨肌肽劑量的增大而升高，具有明顯的量效依賴性。20 mmol/L達最大值。見表1。

2.2 肌肽對NF-κB P65基因mRNA表達的影響 RT-PCR結果顯示，用20 mmol/L的肌肽預處理PC12細胞，再用H2O2處理細胞后，NF-κB P65 PCR產物的條帶變淡，說明肌肽作用于PC12細胞后，其NF-κB P65基因mRNA的表達下降。

2.3 肌肽對NF-κB P65蛋白的表達的影響 免疫組化SABC法表明肌肽可降低由H2O2導致的NF-κB P65蛋白表達。保護組NF-κB P65蛋白表達為26.3%，較損傷組(39.1%)明顯降低(P＜0.05)，與正常組(11.8%)比較(P＜0.01)，陽性細胞數增多，陽性著色加深，或見顆粒樣物質。

表1 L-肌肽對H 2 O2抑制PC12細胞增殖的影響(x ± s，n=6)

3 討論

近年研究表明活性氧和氧化應激在神經退行性疾病的發病中起著重要的作用〔3〕。神經組織中含有大量易被氧化的不飽和脂肪酸以及低水平的抗氧化物質，使其更易受到活性氧的損傷〔4〕。H2O2是一種活性氧成分，它參與了許多神經系統疾病的發病機制。常用作神經細胞氧化損傷的誘導劑。PC12細胞在神經生長因子的作用下能夠分化獲得神經細胞表現型，具有神經細胞的一般生物學特征，能穩定傳代，可以作為神經細胞的體外模型。H2O2可以誘導PC12細胞損傷凋亡〔5〕，其機制包括誘導凋亡相關基因Caspase-3和NF-κB P65的表達和胱天蛋白酶Caspase的活化等〔6〕。目前，肌肽已作為抗衰老、抗白內障藥物應用于臨床。最近，又有學者提出了肌肽有抗凋亡的作用〔7〕。氧化應激導致的神經細胞凋亡又是AD的重要機制之一，肌肽的神經保護是否與抗凋亡有關呢?這正是本實驗的立題依據所在。NF-κB是一種具有多向轉錄調節作用的蛋白質，它分布廣泛并調節多種基因的轉錄調控，參與炎癥反應、免疫應答以及細胞的增生、轉化和凋亡等重要的生理病理過程。曲喜英等〔6〕H2O2誘導PC12細胞凋亡結果也表明，H2O2濃度增大NF-κB P65mRNA及蛋白表達水平增加。Boehrer等〔8〕研究證實Aβ可激活培養神經元內NF-κB的表達，認為NF-κB在AD發病機制中起重要作用。Del Rio等〔9〕用多巴胺誘導神經細胞凋亡中發現NF-κB、P53和c-lun轉錄因子都被激活。本研究證實肌肽具有神經保護作用。有研究表明，NF-κB P65激活可以使細胞編碼的抗凋亡蛋白迅速下降，包括Bcl-2、鈣結合蛋白及凋亡蛋白的抑制因子;促凋亡蛋白上升，如P53、Par-4等。本研究結果表明NF-κB P65可能參與了H2O2誘導細胞凋亡的過程，肌肽能抑制PC12細胞的凋亡，機制可能是通過抑制NF-κB P65基因的表達來實現的。

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8 Boehrer S，Chow KU，Beske F，et al.In lymphatic cells par-4 sensitizes to apoptosis by down regulating bcl-2 and promoting disruption of mitochondrial membrane potential and caspase activation〔J〕.Cancer Res，2002;62(6):1768.

9 Del Rio MJ，Velez Pardo C.Monoamine neurotoxins-in-duced apoptosis in lymphocytes by a common oxidative stress mechanism:involvement of hydrogen peroxide(H2O2)，caspase-3，snd nuclear factor kappa-B(NF-kappaB)，P53，c-Jun transcription factors〔J〕.Biochem Pharmacol，2001;63(4):677.