黃瓜香總黃酮對H2O2誘導的肝損傷的保護作用

陳婭萍 史廷嬌 高淞文 唐丁卯 鄧 葵 李春艷

1．湖南省吉首大學醫學院07級臨床醫學，湖南 吉首 416000;2．湖南省吉首大學醫學院機能實驗教研室，湖南 吉首 416000

黃瓜香學名蔓莖堇菜、葡付堇，屬堇菜科，堇菜屬(Viola diffusa Ging)，多年生草本植物，是盛產于湖南湘西等地區的一種中草藥。其主要化學成分為黃酮類，具有清除自由基，抑制過氧化損傷作用［1－2］。本實驗室以黃瓜香為研究對象，對它的活性成分——總黃酮進行提取分離，并用傳代培養的肝HapG2細胞，通過H2O2建立氧化應激損傷的細胞模型，研究總黃酮對肝HapG2細胞氧化應激損傷的保護作用，為實現黃瓜香提取物在臨床上的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 儀器 二氧化碳培養箱、倒置顯微鏡、超凈工作臺、TGL216G高速臺式離心機、UV－3系列紫外可見分光光度計、酶聯免疫檢測儀、全自動生化分析儀 (均為上海美譜達儀器有限公司)。25cm2細胞培養瓶、96孔培養板、6孔培養板 (均購于碧云天公司)。

1.1.2 試劑和藥品 黃瓜香醇提物，傳統方法醇提、濃縮，臨用時用雙蒸水稀釋成所需濃度 (實驗所用劑量均以生藥計)，并用0.22um濾過膜濾過。DMEM培養基、胎牛血清、PBS液(均由碧云天公司提供)，雙氧水 (成都化工原料有限公司)，二醛 (MDA)試劑盒、基噻唑藍 (MTT)、ALT測試劑盒(均購于碧云天公司)，無水乙醇、乙醚等其它化學試劑均為分析純，雙蒸水 (吉首大學創新實驗室提供)。

1.1.3 細胞 肝細胞為HapG2細胞，購于武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 黃瓜香總黃酮的分離純化

本實驗所用黃瓜香采自湖南湘西，夏末采集，全植物干燥后粉碎，加入60%的乙醇，80℃條件下提取，提取液經過濾、乙醚萃取、再過濾，得黃瓜香提取物 (總黃酮)。

1.2.2 肝細胞培養及損傷模型的建立

將原代HapG2細胞，加入胰蛋白酶溶液8ml，37℃消化，蓋好瓶蓋在倒置顯微鏡下觀察，當細胞收回突起變圓時立即翻轉培養瓶，倒掉胰酶，加入含10%牛胎血清的新鮮培養基10ml，稀釋成含5×106/L個細胞細胞懸液，將細胞懸液接種于96孔培養板中和6孔板 ，96孔培養板100μl/孔，6孔板2ml/孔，置 CO2培養箱 (5%CO2，95%空氣，37℃)中培養2h。待細胞長至對數期后分組實驗:對照組:只加入含牛胎血清的培養基孵育1h;H2O2損傷模型組 (H2O2):加入0.6mmol/L H2O210ul，孵育1h，建立氧化應激損傷模型;黃瓜香－1.0、3.0、10.0、30.0干預組:每組分別加入終質量濃度為 1.0mg/L、3.0mg/L、10.0mg/L、30.0mg/L的黃瓜香及0.6mmol/L的H2O2孵育1h;每組設3個重復。

1.2.3 MTT法檢測 將三個分組分別加入 DMSO 100 ul/孔，按試劑盒說明步驟，待甲臜完全溶解后，用酶聯免疫檢測儀在波長570nm處讀取吸光度 (A 570)。

1.2.4 ALT的檢測 將分組實驗后肝細胞經離心 (1800r/min，10min)后收集上清，按試劑盒說明書步驟操作，用全自動生化分析儀速率法檢測，結果以U/孔表示。

1.2.5 MDA含量的測定 用胰蛋白酶消化分組培養至貼壁的HapG2細胞細胞，收集2×106細胞，用PBS洗2次。待細胞分散后，將各組細胞的培養液倒掉，將細胞裂解后，根據試劑盒說明步驟操作，測定MDA含量，可見光分光光度計532 nm測上清液的吸光值，吸光值表示丙二醛含量的多少，吸光值越大，丙二醛含量越高，結果以mmol/孔計。

1.3 統計學方法 經SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，數據用±s表示，計量指標用方差分析。以α=0.05為檢驗水準。P＜0.05認為差異有統計學意義，相差顯著;P＜0.01時為相差非常顯著。

2 結果與分析

2.1 黃瓜香總黃酮對H2O2誘導的HapG2細胞增殖的影響

MTT實驗是檢測細胞活力的實驗方法，活細胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解產生蘭色結晶狀甲臜顆粒積于細胞內和細胞周圍，其量與細胞數呈正比，也與細胞活力呈正比［3］。因此MTT常常用來檢測細胞的增殖情況。采用熒光免疫法測定細胞活性 (MTT)，以實驗分組為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制柱狀圖，見圖1。

由圖1可知，與模型組比較:對照組HapG2細胞增殖活躍 (P＜0.01);黃瓜香各劑量組HapG2細胞增殖隨黃瓜香濃度的增加而逐漸增加 (黃瓜香濃度為3.0mg/L時P＜0.05，黃瓜香濃度為10.0mg/L時P＜0.01)，說明黃瓜香總黃酮能促進H2O2誘導的肝HapG2細胞的增值。

2.2 黃瓜香總黃酮對H2O2誘導的HapG2細胞受損的影響

ALT是一種非血漿特異酶，是肝功能檢驗的重要指標，是反映肝細胞受損最敏感的指標［4］。采用全自動生化分析儀速率法檢測細胞培養液ALT的水平，觀測黃瓜香總黃酮對H2O2誘導的HapG2細胞受損的影響程度，結果見圖2。由圖2可知，與模型組比較:對照組HapG2細胞無明顯受損 (P＜0.01);黃瓜香各劑量干預組HapG2細胞受損明顯降低 (黃瓜香濃度為3.0mg/L時P＜0.05，黃瓜香濃度為10.0mg/L時P＜0.01)，說明黃瓜香總黃酮能降低H2O2誘導的HapG2細胞受損，具有保護肝HapG2細胞的作用。

2.3 黃瓜香總黃酮對H2O2誘導的HapG2細胞脂質過氧化的影響

MDA是介導自由基損傷的重要物質，可與蛋白質、核酸、堿基、生物胺、磷脂等含有氨基的物質作用而發生交聯，導致生物大分子及生物膜結構的損傷［5］。其作為生物膜磷脂中多不飽和脂肪酸受自由基攻擊而產生的終產物之一，可以反映出體內脂質過氧化損傷的水平。分光光度法檢測細胞丙二醛 (MDA)水平，檢測黃瓜香總黃酮對H2O2誘導的HapG2細胞受損的影響，結果見圖3。

由圖3可知，與模型組比較:對照組肝HapG2細胞無明顯脂質過氧化損傷 (P＜0.01);黃瓜香各劑量組HapG2細胞脂質過氧化損傷程度隨黃瓜香濃度的增加逐漸降低(黃瓜香濃度為 3.0mg/L時 P＜0.05，黃瓜香濃度為10.0mg/L時P＜0.01)，說明黃瓜香總黃酮能抑制脂質過氧化反應，降低H2O2誘導的HapG2細胞的損傷。

3 結論與討論

黃瓜香化學成分主要為黃酮、糖類、粘液質［6］。植株總黃酮含量為2.39%，根總黃酮含量為1.08%，細胞懸浮物總黃酮含量為0.76%［7］。本實驗采用 H2O2誘導肝HapG2細胞損傷，建立體外氧化應激損傷模型。實驗選用了0.6mmol/L H2O2誘導損傷1h，使肝細胞處于尚能保護的自由基環境，保證了實驗的可行性，與某些文獻報道的濃度基本吻合［8］。

本實驗顯示:黃瓜香總黃酮具有很強的體外抗氧化能力，可以促進H2O2誘導的肝HapG2細胞的增殖，抑制脂質過氧化反應，對氧化應激狀態中的肝HapG2細胞具有保護作用。黃瓜香濃度為3.0mg/L時有統計學差異，濃度為10.0mg/L有顯著統計學差異。提示黃瓜香能有效減低氧化應激損傷，發揮對肝細胞的保護作用。其機制可能與生物類黃酮藥理作用一致:黃瓜香水提物中所含有的黃酮，能提供大量的酮羥基還原自由基，從而起到抗自由基作用。且體外試驗還表明:黃瓜香提取物對·OH均具有良好清除作用，且濃度愈大清除率愈高［9］，表明黃瓜香提取物是良好的羥自由基清除劑，能減輕H2O2引起的肝細胞脂質過氧化，并對肝細胞有保護作用。弄清楚黃瓜香抗肝損傷的機制，并對其進行開發，不僅具有重要的社會效益而且具有重要經濟效益。

［1］孫福祥，楊明霞，娜仁花，等.棗總黃酮對阿霉素所致紅細胞過氧化的抑制作用［J］．中成藥，2001，23(8):606．

［2］李春艷，李先輝，呂江明，等．黃瓜香提取物對小鼠免疫功能調節的實驗研究［J］．時珍國醫國藥，2008，19(149):41－42．

［3］司徒鎮強，吳軍正．細胞培養［M］．西安:世界圖書出版公司，2004:198:220．

［4］康格非．臨床生物化學和生物化學檢驗［M］．北京:人民衛生出版社，1998:160．

［5］文漢，聶凡．絞股藍提取物對自由基清除能力的初步研究［J］．安徽農業科學，2001，29(1):121－122．

［6］陳由強，林國宇，等．蔓莖堇菜總黃酮含量的測定［J］．福建師范大學學報 (自然科學版)，2000，4(16):67 －69．

［7］中國科學院中國植物志編輯委員會．中國植物志．［M］．北京:科學出版社，1991，51:35－36．

［8］尹小萍，林冠宇，寶麗，等．正膏坊龜苓膏對氧化應激狀態的改善作用［J］．食品科學，2009，30(5):239－243．

［9］楊俊林，沈恂．生物系統中活潑中間體與脂質過氧化［J］．學通報，1997:(6):5．