Maspin、bFGF在宮頸病變中的表達及與高危型HPV的相關性研究

陳 輝，米淑玲，尹利榮，馬洪達，孫俊杰，王宇全

（天津醫科大學第二醫院婦科，天津300211）

宮頸癌（cervical cancer,CC）已被世界衛生組織(WHO)列為威脅女性生命的第二大惡性腫瘤。有研究顯示，99.8%的宮頸癌合并高危型人乳頭瘤病毒（高危型HPV）感染，其通過病毒基因蛋白與細胞癌基因和抑癌基因相互作用,干擾細胞的正常周期監測機制,使宿主細胞獲得異常增殖能力而發生惡性轉化,這是高危型HPV致癌的中心環節，但宮頸病變如何由慢性宮頸炎→宮頸上皮內瘤樣變（CIN）→宮頸癌，目前國內外學者正從不同的角度進行研究和探索。乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑（Maspin）基因是最新發現的腫瘤抑制基因，研究證實其在某些腫瘤的發生發展中起重要作用；堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）是一種廣譜的有絲分裂原，具有促進腫瘤細胞及血管內皮細胞增殖的作用，但有關高危型HPV感染的宮頸病變患者中兩者的研究少見報道。本研究通過免疫組化法檢測Maspin、bFGF在宮頸病變中的表達情況，探討兩者在宮頸病變發展過程中的相關性及與高危型HPV感染的關系。

1 資料與方法

1.1 資料 收集2009年3月-2010年12月在天津醫科大學第二醫院婦科行宮頸手術或活檢病人的宮頸石蠟組織標本共166例，其中高危型HPV（+）組106例：慢性宮頸炎組20例、CIN組共60例（CINⅠ級20例、CINⅡ級20例、CINⅢ級20例）及宮頸癌組26例；HPV（-）CIN組共60例：CINⅠ級35例、CINⅡ級20例、CINⅢ級5例。慢性宮頸炎組、CINⅠ級組、CINⅡ級組、CINⅢ級組及宮頸癌組平均年齡分別為（35.40±6.51）歲、（38.13+7.36）歲、（37.92+8.14）歲、（37.83+6.80）歲、（37.26+6.99）歲，組間比較差異無統計學意義（P均>0.05）。患者均無其它惡性腫瘤病史，獲取標本前均未接受過放療及化療，均經病理檢查證實診斷。

1.2 試劑和方法 采用兔抗人Maspin單克隆抗體（美國SantaCruz公司），稀釋濃度為1∶75，兔抗人bFGF單克隆抗體（美國SantaCruz公司），稀釋濃度為1∶75。即用型免疫組化試劑盒購自天津灝洋生物制品有限公司。選取患者的宮頸活檢標本，常規石蠟包埋，連續切片，厚度為4 μm，采用免疫組化SP法，增敏二氨基聯苯胺（DAB）顯色，具體操作按相關標準進行，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判斷 Maspin主要定位于細胞核，bFGF主要定位于細胞漿，但兩者評判均以細胞核和（或）漿內出現棕黃色顆粒為陽性細胞。根據著色強度和陽性細胞百分比進行綜合評定。（1）著色強度計分判定：無顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深褐色為3分。（2）染色的陽性細胞所占比例評定標準：每個切片隨機抽取5個高倍視野，陽性細胞數<5%為 0分，5%～25%為 1分，26%～50%為 2分，51%～75%為3分，>75%為4分。2種評分相加，將結果分為 4個等級，0～1分為-，2分為+，3～4分為++，5～7 分為+++，將+～+++均記為陽性計算陽性率，陽性率=陽性例數/觀察總例數×100%。

1.4 統計學分析 應用SPSSl3.0統計分析軟件，計數資料樣本率之間的比較采用χ2檢驗，Maspin、bFGF及高危型HPV三者的相關性均采用Spearman相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Maspin、bFGF 在高危型 HPV（+）組不同宮頸組織中的表達情況

2.1.1 Maspin蛋白在高危型HPV（+）組不同宮頸組織中的陽性表達率逐漸下降（P<0.05）；在慢性宮頸炎、CIN I級、CINⅡ級組織中的表達相比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；在CINⅢ級、宮頸癌組中Maspin蛋白的表達率同其它各組相比，以及這兩組之間相比，差異均有統計學意義（均P<0.05），見表1。

表1 Maspin蛋白在高危型HPV（+）宮頸組織中的表達Tab 1 The expression of Maspin protein in high-risk type HPV+cervical carcinoma

2.1.2 bFGF蛋白在高危型HPV（+）不同宮頸組織中的陽性表達率逐漸增加（P<0.05），在慢性宮頸炎組的表達同CINⅢ級、宮頸癌組相比，差異均有統計學意義（均P<0.05）；CIN各組間相比較差異均無統計學意義（均P>0.05）；在宮頸癌組中的表達與慢性宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ組間比較差異均有統計學意義（均P<0.05）。見表 2。

2.2 Maspin、bFGF 蛋白在 HPV（-）CIN 組中的表達情況

2.2.1 Maspin蛋白在HPV（-）CIN組中的CINⅠ級組、CINⅡ級組、CINⅢ級組的陽性率逐漸下降，但組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表2 bFGF蛋白在高危型HPV（+）宮頸組織中的表達Tab 2 The expression of bFGF in high-risk type HPV+cervical carcinoma

表3 Maspin蛋白在HPV（-）宮頸組織中的表達Tab 3 The expression of Maspin protein in HPV-cervical carcinoma

2.2.2 bFGF在HPV（-）CIN組中的CINⅠ級組、CINⅡ級組、CINⅢ級組的陽性率逐漸升高，但差異無統計學意義（P＞0.05），見表 4。

表4 bFGF在HPV（-）宮頸組織中的表達Tab 4 The expression of bFGF in HPV-cervical carcinoma

2.3 Maspin、bFGF表達與高危型HPV的相關性分析 在CIN組中，Maspin蛋白的表達與高危型HPV呈負相關（r=-0.205，P=0.024）；bFGF 蛋白的表達與高危型HPV呈正相關（r=0.189，P=0.038）。在高危型HPV（+）的宮頸病變組織中，Maspin與bFGF的表達水平呈負相關（r=-0.325，P<0.001）。

3 討論

3.1 Maspin、bFGF蛋白與宮頸病變的關系及兩者的相關性 Maspin是1994年Zou等[1]用消減雜交技術從正常乳腺上皮細胞中分離出的一種新基因，定位于染色體18q21.3-q23屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin超家族的成員之一。不同組織定位不同，可以表達在細胞核和（或）細胞漿，因該蛋白具有穩定的三級結構，因此可通過免疫組化的方法檢測。有研究表明，Maspin不僅具有抑制腫瘤細胞侵襲和轉移的功能，降低腫瘤細胞活性，減弱癌細胞侵蝕活性及轉移能力，還作為有效血管生成的抑制因子，其通過改變細胞表面黏合素結構或直接減少微血管數量誘導細胞凋亡等多種途徑發揮抑癌作用[2-3]。國外有關Maspin在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌等的研究[4-7]充分證明了Maspin在腫瘤發生中所起到的重要作用。有研究結果提示宮頸癌Maspin表達與臨床分期、腫瘤浸潤深度及淋巴結轉移密切相關，且隨訪發現Maspin陰性組和陽性組生存狀況也有明顯差異[8]，故Maspin的檢測可能有助于對宮頸癌惡性程度和預后的評估和預測；但其在CIN組及與HR-HPV的相關性研究國內外報道甚少。本研究檢測Maspin在高危型HPV（+）的慢性宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級、宮頸癌5個組別中的表達情況，結果顯示Maspin的表達隨著宮頸病變由慢性宮頸炎→CIN→宮頸癌的發展而依次下降，推測Maspin作為腫瘤抑制基因，在CIN及宮頸癌的發生中抑制癌變的發展。當發展至CINⅢ及宮頸癌，Maspin的表達同慢性宮頸炎組、CINⅠ級組、CINⅡ級組比較差異有統計學差異，這一結果與Xu等[9]在宮頸癌中的研究結果一致，因此，若高級別CIN中Maspin的表達強度減弱，提示這些病變更具有發展為宮頸癌的可能，即Maspin在宮頸病變由高級別CIN到原位癌甚至到浸潤癌的惡性進展過程中有重要作用。

bFGF作為一種細胞絲裂原和促血管生長因子在體內分布廣泛，但都是微量表達，而在多種腫瘤細胞中明顯高表達。bFGF基因可產生多種異構體,在細胞核、細胞質、胞膜中皆有表達，存在于細胞質中的bFGF是血管生成因子，以自分泌或旁分泌方式參與腫瘤間質血管生成的調節,促進細胞遷移、有絲分裂和增殖，參與腫瘤發生、血管生成、腫瘤轉移等多種過程。還有研究結果顯示：bFGF與腫瘤病理分級、分期正相關，并與預后負相關,這在宮頸癌[10]中也得到證實。本實驗檢測bFGF在高危型HPV（+）的慢性宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級、宮頸癌5個組別中的表達情況，結果顯示bFGF的表達隨宮頸病變由慢性宮頸炎→CIN→宮頸癌的發展而依次上升，雖慢性宮頸炎組、CINⅠ級組、CINⅡ級組之間無顯著性差異，但慢性宮頸炎組與CINⅢ組、宮頸癌組相比，差異有統計學意義，推測bFGF可能在宮頸癌的發生、發展過程中發揮重要作用。故bFGF的檢測可了解宮頸病變的進展并可能有助于對宮頸癌惡性程度和預后的評估和預測。

本實驗發現在高危型HPV（+）的宮頸病變組織中，Maspin、bFGF蛋白的表達呈負相關，2007年王東林等[11]在膠質瘤的研究中也報道過兩者的負相關關系，故推測在宮頸病變的發展過程中，Maspin表達減少在一定程度上導致bFGF表達上調，促進宮頸病變中腫瘤血管的形成，從而進一步促進浸潤和轉移。

3.2 高危型HPV與Maspin、bFGF的相關性 高危型HPV感染與宮頸癌高度相關，以往研究認為高危型HPV E6原癌蛋白是高危型HPV的主要轉化蛋白，此原癌蛋白主要是通過P53與泛素連接酶E6-AP形成復合物，使P53泛素化分解而失去對細胞生長負調節的功能，從而引起細胞無限增生并向惡性轉化[12]。

體外研究發現Maspin表達受野生型p53的直接調控，p53與Maspin啟動子上特異位點結合，激活Maspin基因啟動子，增強轉錄活性。本研究通過檢測Maspin在高危型HPV陽性、HPV陰性的CIN組中的表達情況，發現Maspin的表達與高危型HPV的感染呈負相關（r=-0.205，P=0.024）；且在HPV（-）的CIN組中Maspin蛋白3組間表達率雖然依次降低，但3組之間的差異無統計學意義，而在高危型HPV（+）CINⅢ組中Maspin的表達明顯低于CINⅠ、CINⅡ級組。Li等[13]研究證實高危型HPV感染隨宮頸病變惡性程度而逐漸升高，其中，高危型HPV16 DNA同CINⅢ級、宮頸癌整合率（35.7%，58.1%）遠高于 CINⅠ級、CINⅡ級（16.7%，18.8%），考慮Maspin蛋白在CINⅢ級及宮頸癌表達銳減可能同高危型HPV整合至細胞遺傳基因中通過P53通路下調Maspin蛋白所致，從而促進宮頸病變由CIN向宮頸癌的進展。

Bernal等[14]對人膠質瘤和肝癌細胞培養所得到的實驗結果發現突變型p53通過bFGF參與腫瘤的血管形成。本研究檢測bFGF在高危型HPV陽性、HPV陰性的CIN組中的表達情況，發現bFGF的表達與高危型HPV的感染呈正相關（r=0.189，P=0.038）。

因此，高危型HPV可能通過P53調節通路下調Maspin的蛋白表達及上調bFGF的蛋白表達促進宮頸癌的發生和進展；Maspin表達下降同bFGF上調有著密切關系。隨著對宮頸病變研究的深入，Maspin及bFGF聯合檢測有可能成為觀察宮頸CIN進展及預后評價的有效指標，可能成為宮頸癌臨床基因治療新的分子靶點，但實際工作中還有很多問題有待進一步的研究和積累。

［1］Zou Z,Anisowicz A,Hendfix M J,et a1.Maspin,aserpin with tumor-suppressing activity in human mammary epithelial cells[J].Science,1994,263(5146):526

［2］Zhang B,Huang T,Liu K,et al.Effects of 5-Aza-CdR on cell proliferation of breast cancer cell line MDA-MB-435S and expression of maspin gene[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2007,27(5):543

［3］Kashima K,Ohike N,Mukai S,et al.Expression of the tumor suppressor gene maspin and its significance in intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2008,7(1):86

［4］Bhattacharyya M,Girish G V,Ghosh R,et al.Acetyl salicylic acid(aspirin)improves synthesis of maspin and lowers incidence of metastasis in breast cancer patients[corrected][J].Cancer Sci,2010,101(10):2105

［5］Sharma G,Mirza S,Parshad R,et al.Clinical significance of Maspin promoter methylation and loss of its protein expression in invasive ductal breast carcinoma:correlation with VEGF-A and MTA1 expression[J].Tumour Biol,2011,32(1):23

［6］Turunc T,Bal N,Dirim A,et al.Maspin expression in renal cell carcinoma and its correlation with clinicopathologic parameters[J].Urology,2010,76(3):765

［7］Sopel M,Surowiak P,Berdowska I.Nuclear maspin expression as a good prognostic factor in human epithelial ovarian carcinoma[J].Folia Morphol(Warsz),2010,69(4):204

［8］方世蘭，嚴倩，張永欣，等.Maspin與p53在宮頸鱗癌中的表達及相關性分析[J].中國婦產科臨床雜志，2009，10(5):377

［9］Xu C,Quddus M R,Sung C J,et al.Maspin expression in CIN 3,microinvasive squamous cell carcinoma,and invasive squamous cell carcinoma of the uterine cervix[J].Mod Pathol,2005,18(8):1102

［10］Luo C F,Hong H L,Lu Y L,et al.Expressions of bFGF and PTEN in cervical carcinoma and their clinical significance[J].Zhonghua Zhong Liu Za Zhi,2010,32(7):533

［11］王東林，王艷芬，施公勝，等.膠質瘤中hTERT、maspin和bFGF表達的相關性及意義[J].癌癥，2007，26(6)：601

［12］田小英.P53基因突變與HPV相關宮頸癌關系的研究進展[J].中國優生與遺傳雜志，2007，15(1):122

［13］Li W,Wang W,Si M,et al.The physical state of HPV16 infection and its clinical significance in cancer precursor lesion and cervical carcinoma[J].J Cancer Res Clin Oncol,2008,134(12):1355

［14］Bernal J A,Iuna R,Espina A,et a1.Human securin interacts with p53 and modulates p53-mediated transcriptional activity and apoptosis[J].Nat Genet,2002,32（2）：306