益氣活血法對大鼠腦缺血再灌注損傷后PI3K/AKT通路的影響*

郜 巒，王 鍵△，胡建鵬，何 玲，菅 威，唐 巍，王曉戎

(1.安徽中醫(yī)學院，安徽合肥 230038;2.安徽中醫(yī)藥高等專科學校，安徽蕪湖 241000)

腦血管病是威脅人類健康的三大疾病之一，以其發(fā)病率高、復發(fā)率高、致殘率高、死亡率高的特點給社會和家庭帶來沉重的負擔，綜述表明，在發(fā)達國家，中風是第三個最常見的死亡原因，也是成年中致殘的最主要原因，帶來了極重的社會負擔和經(jīng)濟負擔［1］。其中，缺血性腦卒中最為多見，卒中后智力障礙與肢體致殘是一嚴重的社會問題和醫(yī)學難題。因此，研究如何促進神經(jīng)再生，重建神經(jīng)網(wǎng)絡，修復損傷的腦組織，從而提高患者的生活質(zhì)量，有著十分重大的意義。隨著腦缺血研究的不斷深入，中醫(yī)藥的防治日益得到醫(yī)學界的重視。多年來，我們課題組一直從事中醫(yī)藥防治中風治則治法研究，較好地闡明了名老中醫(yī)王樂匋教授所創(chuàng)立的益氣活血法及其代表方劑腦絡欣通的神經(jīng)保護作用。本次研究擬選用大腦中動脈線栓法制作局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，觀察局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠缺血半暗帶PI3K/AKT通路的動態(tài)表達及益氣活血方藥對其影響，探討其神經(jīng)保護機制。

1 材料

1.1 實驗動物

健康SD大鼠120只，體重280～320g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(皖)2011－002，實驗前飼養(yǎng)觀察3d。

1.2 藥物與試劑

益氣活血法方組藥物為腦絡欣通 (由黃芪、川芎、當歸、三七、蜈蚣等組成)，益氣法組藥物為黃芪，活血法組方為川芎、當歸、三七、蜈蚣等構成。PI3K/AKT試劑盒、DAB顯色劑均由武漢博士德生物科技有限公司提供。

1.3 主要儀器

T3－200型分析天平:成都科學儀器廠。101－A恒溫干燥箱:寧波自動化儀表廠。石蠟包埋機:英國HIS2TOCENTRE公司。石蠟切片機:英國FINESSE公司。OLYMPUS VANOX顯微鏡。

2 方法

2.1 分組方法

實驗動物隨機分為假手術組、模型組、益氣活血法方組 (腦絡欣通組)、益氣法方組、活血法方組。每組再分為缺血再灌注 3d，7d，14d 3個亞組。

2.2 模型制作方法

參考Longa大腦中動脈線栓法改良制作局灶性腦缺血再灌注動物模型。動物稱重后，以10%水合氯醛 (0.36mL/100g體重)麻醉大鼠，頸前術區(qū)脫毛、消毒，沿頸部正中線切開皮膚，逐層分離暴露頸總、頸外、頸內(nèi)動脈，結(jié)扎并剪斷頸外動脈遠心端，從近心端做切口置入直徑為0.25mm尼龍線，(頭端加熱成直徑約0.30mm的圓球形)由頸外向頸內(nèi)插入約18～20mm，感覺少許阻力為止，阻斷大腦中動脈血流，逐層縫合切口。缺血2h后再灌注時，將尼龍線拔出約10mm。模型成功的標志為出現(xiàn)同側(cè)Horner征和對側(cè)前肢為重的偏癱。假手術組只分離，不插入尼龍線。

2.3 給藥方法

益氣方、活血方、益氣活血方由安徽中醫(yī)學院中藥制劑室制備成湯劑，根據(jù)以往藥效學實驗結(jié)果，益氣、活血、益氣活血組分別按 3.5g/kg、5.04g/kg、8.54g/kg(即 1.42mL/kg，1.56 mL/kg，1.34 mL/kg)，每日總劑量分早晚2次灌胃使用。假手術組及模型組按同樣方法予以等量生理鹽水灌胃。給藥時間分別為3d，7d，14d。

2.4 取材方法

每組動物均于缺血2h再灌注，分別于腦缺血再灌注3d，7d，14d后麻醉大鼠，打開胸腔，于右心耳部剪一小口，從左心室插入導管至主動脈，向主動脈內(nèi)緩慢注入37℃肝素化的生理鹽水200mL，至右心房流出液變清亮，注入4%多聚甲醛溶液250mL進行內(nèi)固定，然后立即取出大腦，正中割開，置于4%多聚甲醛溶液中固定。固定1周脫水、透明、浸蠟，連續(xù)腦部冠狀切片。

2.5 指標檢測方法

PI3K、AKT指標均用免疫組織化學SABC法測定，均由專業(yè)人員嚴格按試劑盒說明書進行操作。

2.6 統(tǒng)計學方法

用南京捷達801圖像分析系統(tǒng)對PI3K、AKT免疫組織化學染色陽性細胞平均吸收光密度進行圖像分析，取平均值。數(shù)據(jù)用 ()表示 ，用SPSS13.0 for Windows軟件處理，采用方差分析。

3 結(jié)果

表1 不同時間點益氣活血法對PI3K影響

表2 不同時間點益氣活血法對AKT影響

實驗結(jié)果顯示，腦缺血再灌注損傷發(fā)生后，模型組和假手術比較，PI3K、AKT表達增加。其中缺血再灌注7d，14d，模型組PI3K表達顯著高于假手術組。和模型組比較，益氣組、活血組、益氣活血組PI3K、AKT表達均增加。其中，活血組在腦缺血再灌注14d，能夠明顯增加PI3K、AKT的表達。益氣活血組在腦缺血再灌注3d，7d，14d，能夠明顯增加PI3K、AKT的表達。

組間比較顯示，益氣活血組在腦缺血再灌注14d，能夠明顯增加PI3K、AKT的表達，顯著優(yōu)于益氣組和活血組。而活血組在腦缺血再灌注14d，能夠明顯增加 PI3K、AKT的表達，顯著優(yōu)于益氣組。

4 討論

腦缺血再灌注損傷是一個涉及多環(huán)節(jié)、多因素、多途徑損傷的過程，目前尚缺乏治療特效的藥物和方法，已有的研究表明中醫(yī)理論指導下的中醫(yī)藥及針灸療法都具有整體良性調(diào)節(jié)作用［2－3］。我們課題組在既往的研究中，從形態(tài)學、血液流變學、凝血和纖溶、興奮性氨基酸、自由基損傷、細胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡、神經(jīng)元與膠質(zhì)細胞的關系、細胞凋亡及其信號轉(zhuǎn)導通路、誘導干細胞增殖分化等環(huán)節(jié)，對益氣活血法及其代表方劑腦絡欣通進行了多角度研究，已證實了其具有較好的神經(jīng)保護作用。

近年的研究表明，PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導途徑是重要的細胞存活信號通路，在多種細胞因子介導的細胞生存中發(fā)揮重要作用［4］。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidy1inosito1－3 kinase，PI3K)是一種細胞內(nèi)蛋白激酶，參與細胞的生長代謝、增殖分化及凋亡等多種生物過程。在神經(jīng)系統(tǒng)中，PI3K參與神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的生存和分化。PI3K的主要下游信號分子是AKT，又稱蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。活化的PI3K催化產(chǎn)生PI－3，4－P2和PIP3，后者誘導無活性的AKT和磷脂酰肌醇依賴的激酶－l轉(zhuǎn)位至漿膜內(nèi)表面，從而實現(xiàn)AKT的激活，通過AKT的活化引起下游靶基因的變化［5－6］。近年來，更有學者日漸重視其在神經(jīng)干細胞中的作用。如有研究提示神經(jīng)干細胞存活依賴于PI3K/AKT途徑的活化［7］。另有學者應用 PI3K特異性阻滯劑LY294002孵育大鼠神經(jīng)干細胞，探討PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路在NSCs中的作用實驗結(jié)果表明，PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路對大鼠NSCs的存活、增殖、分化起重要作用，且LY294002對NSCs的存活、增殖和分化的影響呈劑量依賴性［8］。

本實驗結(jié)果顯示，腦缺血再灌注損傷發(fā)生后，模型組和假手術比較，PI3K、AKT表達增加。PI3K/Akt信號通路是細胞的凋亡過程中的一條重要存活通路，腦缺血再灌注發(fā)生后，PI3K/Akt信號通路激活，起到神經(jīng)保護作用。實驗結(jié)果提示，腦缺血再灌注損傷發(fā)生后，益氣活血組能夠明顯激活PI3K/AKT信號通路，且顯著優(yōu)于益氣組和活血組。而組間的比較還顯示，活血組在腦缺血再灌注14d，能夠明顯增加PI3K、AKT的表達，顯著優(yōu)于益氣組。提示益氣藥物可能需配合活血方法一起使用，才能顯示其最佳療效。實驗表明，益氣活血法腦保護作用的可能機制是上調(diào)細胞存活信號通路PI3K/Akt通路的表達，從而對腦缺血模型大鼠腦組織產(chǎn)生保護作用，其具體作用機制有待進一步研究。

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